GOLM1通过上调NEAT1促进肺纤维化——协和徐凯峰教授、张宏冰教授团队最新研究
来源: 协和呼吸 01-28


2023年11月,北京协和医院徐凯峰教授、协和医学科学院基础研究所张宏冰团队在“American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology”杂志上发表文章“GOLM1 Promotes Pulmonary Fibrosis through Upregulation of NEAT1”(最新影响因子:6.4)。



GOLM1通过上调NEAT1促进肺纤维化


作者:王亚妮#,胡丹婧#,万林燕,杨舒慧,刘松,王梓熙,李杰,李佳,郑周德,程重生,王亚南,王行行,田欣伦,陈文慧,李单青,张稷,查晓军,陈静瑜,张宏冰*,徐凯峰*


摘要:


特发性肺纤维化(IPF)是以不可逆进展为特点的一种肺部疾病,治疗手段有限。发病机制与成纤维细胞的异常激活相关,但具体机制不明。首先,在IPF患者和博来霉素诱导产生肺纤维化的小鼠中均出现了高尔基膜蛋白1(GOLM1)的表达上调,提示GOLM1可能是肺纤维化发病机制的一环。体外实验显示,沉默GOLM1表达,可导致成纤维细胞的增殖、分化和细胞外基质的沉积减少;相反,过表达GOLM1会增强这些纤维化过程。体内实验结果进一步证实,GOLM1过表达小鼠在博来霉素给药后表现出加剧的纤维化反应,而GOLM1敲除小鼠肺纤维化程度较轻。其次,该研究进一步确定了长链非编码 RNA (lncRNA) NEAT1受GOLM1正性调控介导纤维化过程。NEAT1的表达下调会抑制成纤维细胞的增殖和细胞外基质(ECM)的产生,从而抵消GOLM1过表达引起的促纤维化影响。最后,转录因子KLF4被发现作为连接GOLM1-NEAT1信号级联的中间介质,共同参与纤维化致病。该研究首次揭示了GOLM1在促进肺纤维化中的关键作用,且GOLM1-KLF4-NEAT1信号轴是针对肺纤维化的治疗策略的潜在靶标。


图1. IPF患者中GOLM1的异常表达


研究结果:


GEO数据库、临床标本数据提示,IPF患者肺组织、外周血中的 GOLM1的基因表达水平较健康对照显著升高。免疫组化、免疫荧光显示,在IPF患者肺组织的GOLM1过度表达,其在成纤维细胞中异常表达。


图2.博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中GOLM1的异常表达


气道注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化,在给药后的第21天处死小鼠,观察小鼠肺部纤维化病变情况。小鼠肺组织H&E染色和羟脯氨酸定量分析结果显示,博来霉素处理组小鼠肺纤维化程度增加。qRT-PCR、Western-Blot、免疫组化结果显示,与对照组相比,博来霉素模型组肺组织中的GOLM1和纤维化相关基因(COL1A1、α-SMA、Fn1)的表达水平升高。从小鼠肺部提取原代成纤维细胞, Western-Blot检测GOLM1在肺纤维化组小鼠原代成纤维细胞中表达明显增高。


图3.体外细胞实验提示GOLM1促进细胞外基质形成、成纤维细胞增殖和细胞迁移


应用shRNA沉默人肺成纤维细胞(ccc-HPF-1)中GOLM1(shGOLM1)的表达。GOLM1沉默细胞中,FN1、α-SMA 和 COL1 蛋白表达下降,成纤维细胞增殖以及迁移受到抑制。反之,过表达GOLM1促进细胞外基质形成,并促进成纤维细胞的增殖和迁移。


图4.GOLM1全身过表达小鼠(GOLM1KI/KI)肺纤维化程度更加严重


借助GOLM1全身过表达小鼠及相对应的野生型小鼠(Wildtype),通过气道注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化。结果示,博来霉素处理后GOLM1KI/KI小鼠比野生型小鼠的存活率更低,体重下降更多。组织学分析(H&E染色、Masson染色、羟脯氨酸定量)显示GOLM1KI/KI小鼠纤维化程度更重,Western-Blot以及免疫组化显示,与野生型小鼠相比,GOLM1KI/KI小鼠细胞外基质表达及沉积更严重。


图5.GOLM1全身敲除小鼠(GOLM1KO/KO)肺纤维化程度减轻


借助GOLM1全身敲除小鼠(GOLM1KO/KO)及相对应的野生型小鼠(Wildtype),通过气道注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化,观察小鼠肺部纤维化严重程度。相较于野生型小鼠,博来霉素处理后GOLM1KO/KO小鼠存活率更高,体重下降更少。肺组织H&E染色、Masson染色以及羟脯氨酸定量显示GOLM1KO/KO小鼠肺部纤维化程度较轻,Western-Blot及免疫组化显示α-SMA、FN1和COL1表达较野生型减少。


图6.GOLM1通过调控lncRNA NEAT1促进肺纤维化的发生


对GOLM1沉默(shGOLM1)和过表达(LVGOLM1)的细胞进行转录组测序,筛选出NEAT1是GOLM1下游基因。对人和小鼠成纤维细胞沉默和过表达GOLM1中的NEAT1进行检测,证实GOLM1正性调控NEAT1的表达。在人成纤维细胞中的过表达NEAT1,纤维化标志物表达升高,成纤维细胞增殖和迁移能力增强。在沉默GOLM1的人成纤维细胞中过表达 NEAT1,其抵消了沉默GOLM1引起的细胞外基质表达的减少、细胞迁移和增殖的降低,同时促进了GOLM1的表达。在过表达GOLM1的人成纤维细胞中沉默NEAT1,本应该出现的纤维化相关蛋白表达增加、细胞迁移增多和增殖活跃均产生逆转,通过FISH及qPCR对IPF患者肺组织中NEAT1的表达进行检测,相较于对照组,患者肺组织中NEAT1表达显著升高。


图7.GOLM1抑制KLF4上调NEAT1促进肺纤维化形成


对NEAT1的启动子序列进行分析,预测KLF4可能与之结合。对KLF4和GOLM1相关性分析示两者呈负相关。在GOLM1沉默和过表达的成纤维细胞中验证了GOLM1负性调节KLF4蛋白水平。用外源性人重组GOLM1蛋白处理成纤维细胞,KLF4表达降低。在GOLM1敲除和过表达的肺纤维化小鼠肺组织中检测KLF4,也验证了这个结论。在肺纤维化小鼠模型和IPF患者肺组织标本中,相较于对照组,KLF4表达降低。而沉默KLF4导致了NEAT1 的表达水平上升,过表达KLF4导致了NEAT1的表达下降,提示了KLF4对NEAT1的负向调控。荧光素酶报告基因和 ChIP证明,KLF4可直接与 NEAT1 启动子结合,从而抑制NEAT1表达。综上,我们提出了GOLM1-KLF4-NEAT1信号轴作为肺纤维化的调控机制。


研究结论:


GOLM1在肺纤维化患者肺组织和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中升高。


GOLM1促进ECM、促进成纤维细胞分化、增殖和迁移。


GOLM1过表达小鼠肺纤维化加重,GOLM1敲除小鼠肺纤维化减轻。


GOLM1正性调控NEAT1促进肺纤维化形成。


KLF4是GOLM1与NEAT1信号通路的中间介质,GOLM1负性调控KLF4,KLF4与NEAT1启动子结合抑制NEAT1表达。


GOLM1-KLF4-NEAT1 轴可能是治疗肺纤维化的新型治疗策略。


第一作者


王亚妮

北京协和医院呼吸与危重症医学科2019级博士研究生,师从徐凯峰教授,现为首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症医学科住院医师。


胡丹婧

中国医学科学院北京协和医院呼吸与危重症医学科2021级在读博士,师从徐凯峰教授。


通讯作者


徐凯峰

北京协和医院呼吸与危重症医学科主任医师、博士研究生导师。中国罕见病联盟呼吸病学分会主任委员。Orphanet Journal of Rare Diseases副主编。长期致力于淋巴管肌瘤病、肺泡蛋白沉积和囊性纤维化等呼吸罕见病的临床与研究。


张宏冰

美国宾夕法尼亚大学医学院博士,哈佛大学医学院博士后、讲师,现为中国医学科学院-北京协和医学院基础医学研究所长聘教授、中华医学基金会杰出教授、国家杰出青年科学基金获得者、全球前2%顶尖科学家、中国高被引学者,主要从事罕见病到常见病的基础与临床研究。



文献来源:American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. doi:10.1165/rcmb.2023-0151OC(原文链接:https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1165/rcmb.2023-0151OC?role=tab)


本文转载自订阅号「协和呼吸」


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