罗红教授:从报告参数、解读流程及难点看“宏基因组检测的临床判读”,如何不遗余力查找下呼吸道感染病原学?丨CACP 2024
来源: 呼吸界 07-05


对于下呼吸道感染或“肺炎”,最基本、最重要的是不遗余力地查找病原学,目前宏基因组在临床的应用非常广泛,它最基本的要求就是“标本合格”,合格后,会涉及到宏基因组检测的“临床判读”。我将从背景、报告参数、解读流程、临床解读难点以及tNGS/mNGS这个方面与大家一起学习。


一、背景


2019年,WHO全球卫生面临的10大挑战中,与感染性疾病相关高达6项;在2024年WHO世界卫生统计报告中,又提到了2021年全球前10位的死亡原因,其中有3个与感染相关,第二位是新冠、第四位是下呼吸道感染、第十位是结核(前10位还包括与呼吸道相关的慢阻肺病),因此,感染性疾病是人类健康主要威胁之一、“感染”是医疗卫生永恒的主题。



下呼吸道感染发病率、病死率高,这也是有依据证实的,根据2016年全球全年龄段下呼吸道感染死亡率分布地图,可见2016年,全球约3.36亿下呼吸道感染发病,237万患者因此死亡。


重症病房感染发生率高,死亡风险大


而在重症病房,这些生命垂危的患者感染发生率高、死亡风险大。2022年《JAMA》有一篇文章,研究者调查88个国家1150个医学中心的ICU,共纳入15202例患者,发现8135例可疑或证实感染,超过一半,其中确诊5419例(66.6%)、疑似1875例(23.1%)、可能789例(9.7%)。在感染类型方面,以革兰阴性菌为主(3540例,67.3%),其次是革兰阳性菌(1946例,37.0%)、真菌(864例,16.4%)和病毒(196例,3.7%)。



临床上的困境是什么?


感染性疾病诊断困难。因为病原种类多、涉及脏器系统多、患者症候群多、可能发生的场景多、宿主类型很多,这种情况下,我们会首先考虑患者的疾病是感染导致的吗?如果是,病原体是什么?针对该病原体的药物敏感谱是什么?做这些思考,才能取得最好的效果。


目前存在的诊断手段中,在形态学方面包括染色等,其阳性率低、不能定种;传统的分离培养与鉴定速度慢、阳性率很低,基层医院较低的检验科水平也会影响诊治;在免疫学检测方面,例如抗原检测,需要预设病原体,这就给诊断带来了许多困惑;在核酸检测方面,过去qPCR-Ct值可用于检测流感和新冠等疾病,但实际临床上,我们不一定能够做出“猜测”,病原体可能有非常多,因此核酸检测的二代测序即宏基因组学出现。因为它是无偏倚、高通量的测序方法,所以能够解决临床上许多问题。


感染性疾病核酸检测方法


如果形容感染性疾病核酸检测方法,PCR是“独杆钓鱼”,它是传统检测技术,只能覆盖少数常见病原,因为需要“基于已知”进行测序,其周转时间和实验时间较长,阳性率低,价格便宜。


在此基础上,metagenomic NGS类似“一网打尽”,共识推荐用于疑难危重症、新发突发等场景,虽然其广覆盖、无偏倚,但也存在不完美之处,如易受环境和背景微生物影响,如无法实现DNA和RNA共检,如果只进行DNA检测,势必导致漏掉非常多的RNA病毒,同时因为费用缘故无法大规模应用,而且宿主核酸易降低灵敏度。


因此,我们现在应用的较多的还有靶向富集重点病原的宏基因组学,即targeted NGS,它不受人源核酸干扰,灵敏度高,可以同时检测DNA和RNA,并且快速,14h-20h就可以得到结果。


宏基因组诊断改变了临床实践,从“预判-验证”到“无需预判”


2019年时,内蒙古-北京的鼠疫便为mNGS提供线索、CDC确诊;COVID-19早期预警方面,最初5名患者BALF RNA mNGS均鉴定出冠状病毒。回想曾经,2003年SARS鉴定耗时5月余,2013年H7N9鉴定耗时1月余,2019年SARS-COV-2鉴定耗时5天。现在它对临床的帮助非常大,但困惑也非常多。


二、报告参数


1、reads数:


reads为测序仪单个测序反应所得到的碱基序列,一般长度为50~75bp的片段;reads数是指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量,与实验的总测序数据量直接相关。为避免总测序数据量高低的干扰,现在存在均一化序列数的概念:每一定的原始序列中(较好的实验室或测序单位往往以100K为例)含有该微生物的序列数,均一化序列数越高,则样本含有该微生物的检测信号越强。


图:每检测数据量为100K的序列,能在这100K的序列中,比对到48622条序列与肺炎支原体相匹配


2、覆盖率:


指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比,覆盖率越高、越分散,通常表示检出该病原体的真实度越高。例如两个样本覆盖率分别为25%和95%,覆盖度达到95%的提示这可能是致病的病原学。



3、相对丰度:


指除去宿主序列之后,某微生物物种序列在相应大类物种(通常分成细菌、真菌、病毒、寄生虫4大类)中的分布比例,比例越高,说明该菌占比越高,致病相对可能性越大。



4、Q值:


指质量分值,用于衡量测序准确度。Q=-10log10P,其中P代表该碱基被测序错误的概率,Q20对应的测序错误概率为1%、准确率99%,Q30对应的测序错误概率为1‰、准确率 99.9%。我们拿到检测报告时可以看到质控信息,合格标准为Q20大于90%、Q30大于85%。下图中,Q30红框处意味着“所有检测碱基中:碱基错误检测概率为1‰的占比96.40%,高于要求的85%”。Q值越高,准确率越高,对实验技术要求越高。因此宏基因组的送选公司非常重要,目前行业内鱼龙混杂,临床医生应该格外注意。



三、解读流程



报告解读分为两部分,技术解读和临床解读。技术

读:检验科室如何出具报告? 其中包括数据质控结果、同批次样本分析、病原体类型、生信比对结果、病原体报出逻辑,以及需要关注的一些问题: NGS检测质量控制如何? 是否可能存在邻位强阳标本污染? 检出病原体原始数据如何分析? 原始数据多,遵循何种逻辑报告? 临床解

读:医生如何解读报告? 要针对临床症状、生化指标、针对性检测、影像学改变等等,需要考虑报告病原体是否和临床资料相符? 报告需要关注哪些重点? 结果是否对临床有意义? 是否应该针对报告进行临床实践的更改?


大家一定都有共识,技术解读和临床解读之间一定要存在信息交流和沟通,临床经常遇到高度怀疑感染,但病原学反复没有阳性发现,在保证标本质量合格的情况下,我们必须与技术方交流沟通,甚至进行MDT,相辅相成、相互沟通才能真正解读好报告。


检测科室如何出具报告?


我们详细了解下检测科室如何出具报告,宏基因组的实验流程分为两部分,湿实验部分(实验室检测)和干实验部分(生物信息分析),实验室检测部分包括核酸提取、文库构建、上机测序;生物信息分析包括碱基识别、数据质控(去接头、去低质量碱基)、去除宿主核酸、参考数据库比对、种属鉴定、结果解读。


不同实验室病原体报告逻辑不尽相同,了解所在实验室报告逻辑有助于报告临床解读。



临床医生如何解读报告?



NGS检测结果用于 LRTI 病原学诊断时应遵循何种流程和路径?


我们在收到一份报告后,首先,需要分析报告质量判断结果可信程度,根据标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信;


第二,检出微生物分级,需要判断是致病性微生物、条件致病微生物、定植微生物(致病性:肺内定植可能低,阳性多考虑感染;条件致病:需结合宿主因素,临床特点综合判断致病性;定植:引起 LRTI 的可能性低,多不考虑致病);


第三,得出结果后,需要结合临床特征、微生物分级进行临床决策,如为致病性的病原体进行针对性治疗,如果是可能致病病原体,危重症患者需要调整抗感染方案+寻找其他证据支持,非危重症暂不调整方案+寻找其他证据支持。


第四,对于阴性结果的临床决策,需要区分“真阴性”还是“假阴性”。


如果经以上流程仍无法确认致病病原体,可组织MDT讨论,还要进行回顾性分析总结,积累临床经验。



宏基因组的报告信息 通常包括样本信息(患者情况、标本来源)、病原体检测结果以及补充列表,此外,还包括病原体解释、耐药和毒力基因检测以及质控信息。

 


1)报告质量:需要根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。高质量mNGS数据要求高质量序列reads数≥20M、Q30>85%,举个例子,下图是不同研究脓毒症血浆游离DNA mNGS的阳性率和灵敏度,从中可见总序列数越多,阳性率越高,但灵敏度并非如此。




2)微生物分级:


定植还是致病?微生物分级有助于区分,临床医生需要根据报告和临床资料把握致病病原体。


有些单位频繁进行宏基因组检测,患者的临床症状可能已经完全改善,仍然培养出鲍曼,因此继续用药。但这时,既然感染已经控制,就不能再仅根据病原学来进行评判。


对于检出微生物致病性分级,《中华结核和呼吸杂志》发布的“下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识”有很大帮助,根据微生物在下呼吸道的致病性特征,初步分为致病性微生物、条件致病微生物、定植微生物。


条件致病微生物致病性的评判难度更大,应根据宿主因素、影像学特征、抗感染药物用药史、治疗反应、传统微生物学检测综合判断,呼吸科医生在这方面非常具有优势。



3)临床决策:该共识还提到结合临床特征、微生物分级进行临床决策,对于“阳性结果”,如为致病病原体,则针对性治疗,如可能致病病原体,危重症患者调整抗感染方案+寻找其他证据支持,非危重症患者暂不调整方案、寻找其他证据支持,必要时MDT;对于“阴性结果”,如怀疑感染,则分析背景微生物、结合其他检测,必要时MDT,如非感染疾病,治疗原发病会得到很好的结果。




4)多学科会诊(MDT)与经验总结:


mNGS检测涉及多个学科专业知识,针对疑难LRTI病例的报告解读,应该组织MDT,MDT应该纳入呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药学等专业人员共同参与,必要时纳入熟悉mNGS试验流程的生信和技术人员参加。病例完成,应进行临床经验总结。


四、临床解读难点


如何对mNGS检测报告的微生物进行致病概率分级?


mNGS 检测结果的解读必须结合常规微生物实验室检测,包括涂片和培养、特殊染色,以及各种分子生物学检测如抗原抗体、PCR、G、GM试验等。


我们曾经遇到过一种情况:患者存在一个拷贝数的结核分枝杆菌,多次X-pert均为阴性,临床症状也不够符合,这时就可持否定态度了,因此提示我们必须结合一些分子生物学检测方法。


辅助 LRTI 判断推测感染病原体常见项目包括血常规、降钙素原 、C反应蛋白、红细胞沉降率等;怀疑非感染性疾病时,鉴别诊断应包括肿瘤标记物、自身抗体谱、免疫球蛋白、补体等;另外,不同病原体LRTI有不同的特点,实变、结节伴空洞、弥漫性磨玻璃改变等考虑方向不同。


如何根据mNGS阴性报告作出临床决策?


大家碰到的mNGS阴性情况越来越多,有可能是“真阴性”,为非感染性疾病:非感染性炎症如结节病、自身免疫性疾病等;肿瘤性疾病;内分泌疾病可有类似肺部感染表现。


还有可能为“假阴性”,有可能是因为:1)特殊病原体难以检出,对于某些病原微生物,如胞内菌、结核分枝杆菌、真菌,考虑mNGS检测灵敏度较低,阴性预测性差,并不一定优于常规检测方案。2)标本/项目选择不正确,例如mNGS会漏掉RNA病毒等,另外胸水并非是很好的标本,因为人源干扰非常多,最好的下呼吸道感染标本是支气管肺泡灌洗液。3)低于检测限:用药有效微生物被抑制或杀死,或病毒核酸载量低,低于报告阈值。这时,需要我们查原始数据,针对性加做怀疑病原体检测——tNGS,PCR。4)关注补充微生物列表:如果实验室不明确是否致病,那么我们可将污染/背景可能性/序列数低列入补充列表。


总之,当回报阴性结果,临床医生应结合病史及疾病演变、影像及其他病原体检测手段综合判断,必要时送检不同部位标本如BALF、血、肺组织等,动态评估抗感染效果。在这种“感染”面前,呼吸科医生的临床思维非常优秀、全面。



案例分析:一位55岁男性,标本类型为“全血”,症状表现为发热、寒战、咳嗽伴咳白痰10天,血象不高,但血小板下降、降钙素原高。全血mNGS结果:EBV(序列数:5);庚型肝炎病毒(序列数:2505),其他常规结果:骨髓培养阴性杆菌;布鲁菌病抗体阳性;血培养布鲁菌属,而且这位患者还有流行病学史。最终虽然宏基因组为阴性,但是临床仍然诊断为布鲁氏菌病。


提示大家,宏基因组无法替代传统病原学诊断技术,应用常规技术检测的同时,或在其基础上开展mNGS,必须同时监测,不能“孤注一掷”。


mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读?


推荐多种检测技术交叉验证,明确主要致病微生物。“假阳性”可能是标本质量不合格,或标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染,或检测过程中背景菌的质量控制不严格,以上是污染的情况,也有可能是与临床不符——患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符,或无法用其他微生物学方法验证;或治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。


另一种情况是“真阳性”,出现了混合感染,例如误吸,对于误吸风险或明确误吸史的患者,如果出现多种常见口腔定植菌,则需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和(或)培养中检出相应的混杂菌群。另外,CAP患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染。大家还特别清楚,免疫缺陷宿主LRTI常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。


标本类型对解读mNGS报告有什么影响?


对呼吸道常见mNGS检测样本进行分类解析,确保临床易用性。


1)痰(包括诱导痰)、气管吸引物、BALF及各种经支气管镜肺活检标本:易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染;BALF标本中致病微生物的载量通常较高,受非致病微生物和人源核酸的干扰较小;肺活检标本的阴性结果并不能排除感染。


2)胸腔积液与肺组织标本:经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染;如mNGS 送检标本为大块的外科手术活检或切除标本,如呈阴性结果,基本可以作为排除感染的重要依据;脓胸中虽然致病微生物的载量较高,但也同时存在大量的炎症细胞,人源核酸占比高,去人源核酸操作可能导致结果呈假阴性,结果未必使我们满意,因此脓胸未必能培养出病原学。


3)血液:血液检出致病微生物序列,不代表该病原微生物来自呼吸道,大家也许经常遇到血液标本检出CMV、EB病毒等DNA病毒,这时是否存在病毒性肺炎,需要结合临床表现、肺部影像表现和下呼吸道标本的检测结果综合判断;血液标本结果受人源核酸的干扰较大;血浆微生物mNGS可能导致某些胞内致病微生物感染出现假阴性。


4)mNGS报告中低 reads 数微生物如何解读?需要从以下几个方面考虑:某些病原微生物的核酸提取效率低和(或)标本中该病原载量较低;采样、运输和实验过程中引入污染可能,结合临床分析之后,若考虑此低 reads 微生物不是致病微生物,应考虑污染或者假阳性结果;生信分析中出现假阳性结果。


最终,临床医生应结合患者临床表现、影像学、常规微生物学检测结果,综合判断该低 reads病原微生物的临床价值。如果怀疑此微生物感染,条件允许时采用其他方法验证。对于难以确定临床意义的低序列数微生物,必要时可进行MDT讨论。



案例分析:患者女性,52岁,标本类型为BALF,阵发性咳嗽、咳痰3周余,伴有低烧,双肺多发实变磨玻璃密度影,考虑感染性病变。血常规、CRP、PCT、ANCA相关抗体、G、GM试验阴性。虽然我们在临床上考虑为感染,但治疗效果不佳,完善纤支镜,BALF mNGS结果:烟曲霉 (序列数 2)。


这时需结合其他临床特征综合分析:是因为曲霉属于厚壁微生物,mNGS检测易出现假阴性吗?本例患者中年女性,无免疫功能低下相关的宿主因素,临床表现不符合肺曲霉病,在微生物学证据方面,患者BALF和血标本的GM均为阴性……证据不足以诊断肺曲霉菌病。


最终行经皮肺穿刺活检,肺组织未检出曲霉,同时病理结果报告符合机化性肺炎。因此修正诊断为隐源性机化性肺炎(COP),给予激素治疗后,病变吸收。


LRTI病原诊断中耐药基因、毒力基因意义如何?


目前我们仍然跟随传统培养的敏感和耐药进行临床工作,共识中特别强调,mNGS可提供耐药与毒力基因,但受限于序列读长和测序深度,尚有一定局限性。


五、tNGS/mNGS


目前因为费用、检测时效等原因也常常推荐tNGS,其相较于mNGS有何差异?tNGS原理是针对目标病原微生物基因序列,设计特异性引物,采用超多重PCR建库体系,对目标序列进行靶向扩增富集。


因此它与mNGS相比,优势是检测时间缩短、敏感度与特异度更好无需检测人源序列,检测成本下降,劣势是病原谱比mNGS“窄”,无法检测未知病原微生物。


而反过来,mNGS与tNGS相比,理论上可检测数据库中所有微生物,可检出新发、未知、罕见病原微生物,但劣势是检测结果临床解释有一定难度,容易受到人源核酸干扰,易受环境微生物、定植微生物干扰,检测成本高。


因此,总体来说,tNGS受环境、定植微生物干扰少,低序列检出情况少,报告解读相对更容易,可以借鉴mNGS报告解读的流程方法。但对于阴性结果,应考虑病原谱原因。


总结


NGS是危重症患者寻找寻找病原学证据的重要方法,我们应该了解NGS的reads、reads数、覆盖率、相对丰值和Q值等参数意义,报告应当按照流程解读,建议为“分析报告质量→对报告微生物分级→结合临床做出决策(阴性结果解读)→必要时MDT→经验总结”。


临床分析的难点主要是微生物致病概率分级、标本类型的选择和解读、低reads微生物检出意义、耐药与毒力基因的解读。


在tNGS报告解读方面,可借鉴mNGS报告解读经验,阴性结果需考虑病原谱。


参考文献

[1] WHO世界卫生统计报告,2024

[2] Lancet Infect Dis,2018,18(11):1 

[3] JAMA, 2020,323(15):1478-1487. 

[4] Gu W et al. Annu Rev Pathol-Mech. 2019. 14(1), 319

[5] 下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识. 中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(4):322-335.


专家简介


罗红

教授,一级主任医师,博士生导师;中南大学湘雅二医院呼吸与危重症医学科主任、危重症亚专科主任;中华医学会呼吸病学分会呼吸危重症学组委员;中国医师协会内科医师分会委员;中国医师协会呼吸医师分会危重症医学工作委员会副主任委员;中国残疾人康复协会肺康复专委会常委兼ICU肺康复学组副组长;湖南省医师协会呼吸医师分会会长;湖南省医学会呼吸病学专业委员会副主任委员。


本文由《呼吸界》编辑 Jerry 整理,感谢罗红教授的审阅修改!


* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考


本文完

责编:Jerry

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