摘要

目的：分析全外显子组测序（WES）技术在肺部疑难病中的诊断价值。

方法：回顾性分析2021年5月至2024年8月于北京协和医院为明确诊断而行WES的肺部疑难病患者，采集其人口学信息、临床资料、WES检测结果，并进行总结分析。

结果：共纳入患者24例，其中男性14例（58.33%），女性10例（41.67%），中位年龄28岁（14~64岁）；使用WES后共发现致病性或可能致病性基因变异结果9个，涉及6个基因，依靠WES明确诊断患者共7例，确诊率为29.17%。7例患者中病种占比最高的是原发免疫缺陷病，此外对于肺受累的罕见病，如血管型爱唐综合征（vEDS），WES也有一定的诊断价值。

结论：WES技术能够有效提升肺部疑难病患者的诊断率，尤其在起病年龄小、反复感染或多部位感染的患者中，推荐行WES。

肺部疑难疾病病因复杂，临床表现多样，因确诊困难而难以获得针对性治疗。这类疾病包括幼年起病反复发生的肺部感染、间质性肺疾病以及肺部少见肿瘤等，其中部分疾病与遗传因素密切相关。遗传性疾病是指由于遗传物质结构或者功能发生改变而导致的疾病，主要包括染色体病、单基因病、多基因病、线粒体遗传病和体细胞遗传病［1］。遗传性疾病表型多样，多为先天性，因此多在儿科就诊，且多数患者在儿童时期已经明确诊断。但部分起病隐匿的患者，可能到成人阶段仍未确诊，或者由于外显率低，症状不典型，以及疾病罕见、医生认识不足等因素，使得诊断更加困难。人类基因组外显子区域占整个基因组的1%~2%，却可以解释85%的遗传病的致病原因［2］。针对该区域的全外显子测序（whole exome sequencing，WES）技术可以检出绝大多数单基因病的致病变异，目前正越来越多地成为医学诊断工具。但先前的研究主要集中在产前诊断［3, 4］以及患有神经系统疾病或发育障碍的儿科患者［5, 6］。在肺部疑难疾病患者中，即使并非儿童，也需要警惕遗传性疾病的可能。本研究描述了本中心一组诊断困难的肺部疑难病患者的临床特征，以及使用WES后的诊断率，旨在对这一技术在此类患者中的应用效果进行探索。

对象与方法

1. 研究对象：回顾性分析2021年5月至2024年8月在北京协和医院诊治的肺部疑难病患者24例。纳入标准：（1）年龄≥14岁；（2）临床评估有以下情况：①幼年起病的反复感染、不明原因的多部位感染、不明原因的机会性感染；②早发的弥漫性实质性肺疾病（diffuse parenchymal lung disease，DPLD）；③下呼吸道病原学阴性的双肺空洞性病变；④经包括侵入性检查等全面医学评估仍不能确诊的多系统受累疾病。排除标准：（1）年龄小于14岁；（2）临床评估存有以下情况：①患者反复感染、多部位感染、机会性感染存在继发的免疫功能缺陷；②多系统受累疾病可使用已知病因解释病情全貌；（3）已确诊为遗传性疾病。本研究得到北京协和医院伦理委员会批准（伦理批准号I-24PJ0613）。回顾性研究豁免知情同意。

2. 研究方法及检测步骤：（1）一般资料采集：记录患者的起病年龄、检测时年龄、性别等人口学信息；（2）临床资料采集：记录起病以来可能与病情相关的家族史、临床表现、病程、影像学特征、最终诊断等；（3）检测：采集患者外周血2 ml（部分患者同时采集了父母的外周血），送至北京智因东方转化医学中心检测。①样本测序：全外显子组测序采用IDT The xGen Exome Research Panel v2.0全外显子捕获芯片捕获并测序完成。②测序数据分析：将测序结果与UCSC hg19人参考基因组进行比较，进行SNP检测和InDel分析，结合致病突变数据库、正常人基因组数据库、已知四千种遗传病临床特征数据库等及基因数据分析算法进行分类分析，采用三要素分类体系以及美国医学遗传学和基因组学学会（American college of medical genetics and genomics，ACMG）指南［7］对变异进行分类。③Sanger验证：对目标序列进行PCR后，对候选变异位点经ABI3730测序仪进行Sanger测序验证，并经序列分析软件得到验证结果。

结果

一、一般临床资料

共纳入患者24例，其中男性14例（58.33%），女性10例（41.67%）。24例患者起病时的中位年龄24.5岁（40 d~64岁），行WES检测时的中位年龄28岁（14~64岁）。所有患者均无发育障碍或表观畸形，父母均为非近亲婚配，有3例患者具有可疑阳性家族史。从临床特点来看，发病年龄在14岁及以下患者7例（29.17%）；病程≥1年以上患者17例（70.83%）；多系统受累患者16例（66.67%）；接受了至少1次侵入性检查（包括气管镜、肺穿刺、其他组织穿刺活检等）而未能诊断患者17例（70.83%）。24例患者的病种分布为可疑免疫缺陷患者11例，DPLD查因患者6例，其他疑难罕见病7例。使用WES后最终仍未能明确病因患者11例。截至统计分析时，死亡2例。

二、全外显子检测结果

24例患者均送检WES，其中17例仅送检先证者，7例包含父母或父母之一，均无子代参与送检。结果分为三类：“确定性诊断”是指与临床表型相关的致病性或可能致病性基因变异，“可能诊断”是指可能与临床表型相关的基因变异，“阴性结果”是指未发现与临床表型相关的基因变异［8］。总体而言，24例患者中，7例患者因发现致病性或可能致病性基因变异而明确诊断，WES的诊断率为29.17%；4例患者检出了可能与临床表型相关的基因变异；13例患者为阴性结果。7例确定性诊断患者中共检出变异位点9个，涉及5种单基因遗传病，其中常染色体显性遗传病3种，常染色体隐性遗传病2种。4例可能诊断的患者检出变异位点7个，涉及4种单基因遗传病，其中常染色体显性遗传病3种，常染色体隐性遗传病1种。

三、确定性诊断患者和可能诊断患者的临床特点

本组患者中诊断率最高的是可疑免疫缺陷患者，此类患者的临床特点为自幼起病的反复感染、不明原因的多部位感染或机会性感染，共11例。使用WES后5例患者确定诊断，诊断率为45.5%。其中慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease，CGD）2例，重症先天性中性粒细胞减少症（severe congenital neutropenia，SCN）1例，普通变异型免疫缺陷病（common variable immunodeficiency disease，CVID）1例，囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）1例。5例患者无家族史，均为幼年起病，发病中位年龄5岁（40 d~10岁），中位病程22年（11~33年）。就感染特点而言，4例原发性免疫缺陷患者为多部位反复感染，1例CF患者表现为反复肺部感染。5例患者存在多种病原体感染，既有常见的金黄色葡萄球菌（患者4）、鲍曼不动杆菌（患者3），也有少见的圣乔治教堂奴卡菌（患者3）、多噬伯克霍尔德菌（患者5）等。此外，还发现可能诊断患者1例，患者11在无继发免疫缺陷的情况下，同时出现肺及肠结核感染并导致了肠穿孔，WES提示为可疑CFTR相关性支气管扩张，因缺乏父母的家系验证信息无法进一步判断。

其次为其他疑难罕见病。该类患者的临床特点为无感染证据的双肺空洞性病变或经全面的医学评估包括侵入性检查后仍不能确诊的多系统受累，共7例。使用WES后2例患者确定诊断，诊断率为28.57%。2例患者均为COL3A1基因变异所致的血管型埃勒斯-当洛综合征（vascular Ehlers-Danlos syndrome，vEDS）。其中患者1父亲有“血管病”病史且已亡故，临床表现为反复发作的咯血、四肢抽搐麻木、意识丧失，体格检查可见小关节过度活动，影像学示肺内多发小空洞；患者2无家族史，表现为反复在癫痫发作后出现发热、咳嗽、咯血，影像学示双肺多发斑片影，可见空洞、肺气囊、肺大泡、气胸。还发现可能诊断患者1例（患者10），该患者临床诊断弥漫性淋巴管瘤病，可能与WES检出的TIE1、FLT4、CELSR1三个基因变异所致的淋巴管畸形部分或全部相关，三个变异致病评级均为意义不明，目前缺乏相关文献支持，还需进行基因功能验证来明确。此外，还有2例患者通过病理检测和多学科讨论后诊断为左股软组织肉瘤、系统性红斑狼疮。

第三为DPLD查因患者，共6例。该类患者临床特点为早发的DPLD，中位起病年龄为28.5岁（23~48岁），均完成了至少1次的支气管镜肺泡灌洗及经支气管镜肺活检未能明确病因。使用WES后发现2例可能诊断患者，其中患者8可能为SFTPA基因变异所致的间质性肺疾病2型，其母亲为间质性肺疾病已亡故；患者9无家族史，可能为TERT基因变异所致的端粒相关性肺纤维化、间质性肺疾病2型。2例患者的基因变异致病评级均为意义不明，尚无法确定诊断。

以上确定性诊断患者7例和可能诊断患者4例共11例患者的详细临床特点及WES结果见表1。

讨论

本研究纳入了一组成人呼吸科肺部疑难病患者，临床特点主要包含以下4类：（1）幼年起病的反复感染、不明原因的多部位感染或机会性感染；（2）早发的DPLD；（3）无感染证据的双肺空洞性病变；（4）经包括侵入性检查等全面的医学评估仍不能诊断的多系统受累疾病。本组患者在使用WES后，7例患者得以明确诊断，诊断率为29.17%，略高于既往包括儿童患者在内的报道［9, 10, 11］；4例患者发现了可能与诊断相关的基因变异，但目前仅通过WES单一手段尚无法建立诊断。按照病种分类后，可疑免疫缺陷患者诊断率最高，为45.5%。此外，WES对于以呼吸系统受累或首发表现的罕见病（如vEDS等）亦有阳性检出。

近年来陆续有研究报道了WES在某类疾病中的应用，如慢性肾脏疾病查因［11］、不明原因发热患者查因［12］，均证实了WES可以帮助诊断，但对肺部疑难疾病的关注不够。美国一项成人WES诊断性研究纳入了486例先证者，总体诊断率为17.5%，其中呼吸系统受累为56例，诊断率约5%，但该队列中的患者并无来自呼吸科医生的转诊［9］。我们通过对本组患者临床特点的描述，展示了WES在成人呼吸科的应用场景，证实了WES可以提高肺部疑难病的诊断率。

本研究中原发免疫缺陷病（primary immunodeficiencies，PID）占比最高，这是一组影响免疫系统发育和（或）功能的先天性疾病，临床上表现为对感染、自身炎性疾病、过敏、肿瘤等易感性增加，但异质性极大，甚至有些患者以危及生命的感染为首发症状［13, 14, 15］。PID目前已知的致病基因包含400余种，按照所致的功能缺陷分为10大类。本研究中患者3、4、5为先天性吞噬细胞数量或功能缺陷，其中与NCF2和CYBA基因相关的慢性肉芽肿病为中性粒细胞呼吸爆发缺陷，SRP54基因缺陷则导致了先天性中性粒细胞减少；患者7为免疫失调，是由CTLA4基因变异导致的调节性T细胞功能缺陷［13］。这些免疫功能缺陷，使得患者反复发生多部位感染、机会性感染、重症感染等，对于此类患者病理检查结果往往仅能反映当时的疾病状态，而无法解释病情全貌，其确诊依赖于基因检测。由于充分的抗生素治疗使得PID患者的寿命明显延长，成人患者逐渐多见，且多为散发，诊断困难［16］。成人患者受环境暴露的影响，其表型可能会被更常见或更复杂的非孟德尔医学疾病的迹象掩盖，使其症状更温和、异质，也使得临床医师易忽视其背后的遗传因素。而WES不仅使患者明确诊断，还通过识别特定的基因变异揭示免疫缺陷的类型及其发病的分子机制。这对为患者提供家系遗传咨询和针对性的治疗至关重要，如造血干细胞移植及可能的靶向治疗等［16］。但目前WES费用仍较高且为自费，从医学经济学的角度出发，临床医师需在充分评估患者病情的基础上送检以提升诊断率。根据本研究的经验，我们提出了关于肺部疑难病使用WES的流程图（图1）。

注：DPLD：弥漫性实质性肺疾病；WES：全外显子检测

图1 肺部疑难病使用WES的评估流程图

虽然我们遵循了严格的送检和诊断流程，本组患者最终仍有11例未明确诊断，一方面考虑可能非孟德尔疾病，另一方面考虑与WES的技术局限性有关。WES仅针对编码区，可能漏掉位于调控区域、内含子区域等可能影响基因功能的变异，对拷贝数变异和结构变异的检出能力有限或无法检出［17, 18］。但除测序技术的限制外，还有其他因素影响了WES的诊断率。首先，WES识别到的意义未明的变异（variant of uncertain significance，VUS）对明确诊断和关联新的基因-疾病构成了挑战［19］。VUS多为错义突变，当前未明确其对功能的影响，基因数据的不断累积可使既往10%~15%的VUS明确其对病因的贡献［20］。本研究中患者3的基因变异虽评级为VUS，但通过功能验证证实了该基因变异位点与疾病相关从而确定了诊断；而4例可能诊断患者均受限于VUS变异的检出未能明确，未来也可通过功能验证或动物建模的方式进一步探索［17］。其次，临床表型驱动的基因检测数据分析可能导致阴性结果。遗传性疾病存在极大的异质性，同种疾病的患者表型可从完全无症状到严重受累，且表型会随时间发生改变，这被认为是基因的不完全外显和可变表现度［21, 22］。因此，通过基因型驱动的数据分析结果重新评估可能的临床表型，即反向表型法，有助于建立更多诊断［22, 23］。第三，基于家系（Trio）的基因检测通过对父母子3人数据的不同分析策略，可以第一时间明确疾病的遗传模式、识别新发变异等，有助于提高诊断率［9，22，24］。本研究受限于部分患者亲本样本的缺失等原因，仅部分患者完成了家系检测。本研究中vEDS为常染色体显性（AD）遗传，患者1父亲有相似症状但已亡故，结合其母亲的WES结果，考虑其致病变异来自父亲。而同样为AD遗传的 SCN患者，其父母表型正常，经家系验证证实为新发突变。需要注意的是，当携带同样基因变异的父母仅受轻度影响或无表型时，该变异则会在AD遗传性疾病中被过滤掉，从而出现漏诊［22］。综上，临床医生应与遗传学专家充分沟通，不确定及阴性的WES结果可在未来做定期数据重新分析，以提升诊断率［17，25］。

本研究还存在其他局限性。首先样本量较少，为单中心回顾性研究，纳入的患者涵盖了多个病种，如未来能按照临床表型或专病进行分析将会进一步提升研究价值。其次，由于肺受累的遗传性疾病存在极大的临床和基因异质性，医疗机构的诊疗能力和水平也影响了患者的诊断率。本中心作为国内最大的疑难罕见病诊疗中心，富集了各地医疗机构转诊而来的复杂疑难病例，所纳入的患者存在一定的偏倚，可能高估了WES的诊断价值。

综上所述，WES是诊断成人肺部疑难病的有力工具。本研究中确定性诊断的7例患者中占比最高的是原发免疫缺陷病，故对于幼年起病、反复感染的患者，推荐行WES；此外，对于无明显炎症存在的不明原因肺部空洞病变患者，WES也有诊断价值。尽管目前大多数的基因缺陷尚缺乏有效治疗，但分子诊断的建立是患者未来能够获得靶向治疗的基础，同时对于探索疾病的发生机制及其上下游的信号通路也至关重要。期待未来有更深入的研究来揭示成人肺受累的遗传病全貌。

参考文献（略）

作者：段圆方 潘思琪 范俊平 王鹏超 余昆容 刘雅萍 王京岚 田欣伦；第一作者单位：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院呼吸与危重症医学科；通信作者：王京岚，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院呼吸与危重症医学科

引用本文: 段圆方, 潘思琪, 范俊平, 等. 全外显子组测序对肺部疑难病的诊断价值分析[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2025, 48(8): 719-725. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20250117-00036.

本文转载自订阅号：中华结核和呼吸杂志

原链接戳：【论著】全外显子组测序对肺部疑难病的诊断价值分析

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责编：Jerry