近年来，碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌因具备耐药谱广和致死率高两大特点，给我国乃至全世界的抗感染治疗带来严峻的挑战。目前，碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的进化遵循两种主流模式：一类是KL1 / KL2型高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）获得外源性耐药质粒/基因，即CR-hvKP；一类是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）外源获得毒力质粒/元件，即hv-CRKP。值得注意的是，KL1 / KL2型CR-hvKP并未在临床形成大规模流行，而ST11-KL64-hv-CRKP则进化成为碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的优势克隆群。尽管ST11-KL64 hv-CRKP的院内流行已被证实，然而促使其成为流行优势株的相关机制仍未阐明。

同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队，通过遴选和表征KL1、KL2和ST11-KL64型，这三种典型碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的分子特点和差异，探索促使优势克隆群流行传播的相关因素，为未来防控该类菌株的临床大规模流行提供线索和思路。该研究发表在《Drug Resistance Updates》（中科院分区1区 Top，2022年影响因子22.841），标题《Characterization difference of typical KL1, KL2 and ST11-KL64 hypervirulent and carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae》，同济大学附属上海市肺科医院检验科周迎为该论文的第一作者，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授为该论文的通讯作者。

该研究从11家中国三级教学医院中分离出109株碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌，依据进化分析从中遴选出三株典型的碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌进行后续研究，分别是：FK3128（KL1型CR-hvKP）， 1390（KL2型CR-hvKP）和1403（ST11-KL64 hv-CRKP）。值得注意的是，三株菌均分离自患有严重基础疾病且预后不良的老年患者。

为明确菌株间的耐药水平差异，我们通过全基因组测序和药敏实验，对这三株菌的耐药分子特点和表型进行表征。研究发现，与ST11-KL64型菌株相比，KL1/KL2型CR-hvKP的耐药基因明显较少，对抗生素的耐药水平也较低。我们在1403发现了10几个耐药基因和2个耐药质粒，而另外两个分离株（FK3128和1390）仅含有一个bla_KPC-2 质粒和2个或3个耐药基因。 同时，KL1/KL2 型CR-hvKP所携带的质粒较少，且不具备ST11-KL64菌株质粒多样性的特点。 其原因可能是，原始的高毒力肺炎克雷伯菌不易从外界获得质粒，且易丢失已获得的质粒。 由于缺乏相应的耐药基因和耐药表型，KL1/KL2 CR-hvKP 菌株在临床医疗环境中，较易被氨基糖苷类或喹诺酮类等抗生素杀灭。 然而，ST11-KL64 CRKP克隆群常呈现多重耐药表型，一旦这些CRKP获得了pLVPK样毒力质粒，进化成为hv-CRKP分离株，它们就很容易在院内传播并引起规模流行。

值得注意的是，虽然三株菌均携带bla_KPC-2基因，但是它们对碳青霉烯类抗生素的耐药水平并不相同，ST11-KL64菌株对亚胺培南和美罗培南的耐药水平更高。先前的研究表明，具有高黏表型的KL1 / KL2 hvKP菌株在获得bla_KPC-2质粒后，并没有表现出相应的高水平碳青霉烯类耐药表型，这与本研究中的观察一致。

我们进一步分析这三株菌的致病能力，荚膜多糖定量实验发现KL1/KL2 型CR-hvKP和ST11-KL64型hv-CRKP均可产生相当的厚荚膜以逃避宿主免疫攻击。尽管ST11-KL64菌株1403形成的生物膜，少于FK3128（KL1 CR-hvKP）和1390（KL2 CR-hvKP），但其与经典高毒力菌株ST23-KL1 hvKP NTUH-K2044的生物膜形成能力相当。此外，高毒力肺炎克雷伯菌通过编码高亲和力的铁载体系统摄取游离铁以减弱宿主细胞的营养和免疫功能。铁载体测定实验表明，1403的铁载体系统摄取能力与KL1、KL2 CR-hvKP相当，并且显著高于ST11-KL47 CRKP（1627，阴性对照）。这些结果表明，这三株菌株中特异性高毒力因子的表达几乎相当。

同时，我们通过A549人肺癌细胞体外感染模型，以及大蜡螟幼虫体内感染模型，进一步评估了这些分离株的毒力潜力。菌株对A549细胞的破坏性越大，检测到该细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）活性就越高。与致病性低的ST11-KL47菌株相比，ST11-KL64菌株显著提高了A549细胞中的LDH活性。大蜡螟幼虫感染模型显示，在感染72小时后，ST11-KL64分离株（1403）和KL1分离株（FK3128和NTUH-K2044）显示出相当的毒力，存活率为0-20%，而KL2分离株（1390）的存活率为40%。毒力阴性对照ST11-KL47 CRKP分离株（1627）的存活率达到90%，表明ST11-KL64 hv-CRKP具备高致病性。

图1：ST11-KL64 hv-CRKP和KL1、KL2 CR-hvKP的毒力表型和毒力水平

进一步分析发现，三株细菌所携带的毒力质粒（p3128-1、p1390-9 和 p1403-9）和 IncFII bla_KPC-2质粒（p3128-2、p1390-4 和 p1403-5）序列覆盖率和相似度高，且与经典毒力质粒（pLVPK，AY378100）和典型blaKPC-2质粒高度相似。这些结果表明，pLVPK样毒力质粒和IncFII bla_KPC-2质粒在碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的形成中起关键作用。

值得注意的是，pLVPK样毒力质粒虽然为非接合型质粒，但是却可移动，因其含有质粒移动所必须的oriT位点，可借助其他质粒的松弛酶和四型分泌系统进行转移和传播。根据上述分析，可接合的IncFII bla_KPC-2质粒似乎是诱动毒力质粒转移的重要因素。进一步研究发现，这些毒力质粒和bla_KPC-2质粒上的oriT位点都是相似且保守的。这一观察结果提供了一个关键线索，pLVPK样非接合型毒力质粒的oriT可以募集bla_KPC-2质粒的松弛酶去启动接合过程。毒力质粒和bla_KPC-2质粒的共存促进ST11-KL64 hv-CRKP的形成，院内抗生素压力进一步促进了该类菌株的流行。此外，由于ST11-KL64 hv-CRKP可携带多个IncFII质粒，pLVPK样毒力质粒可以在辅助质粒的帮助下转移至其他菌株。

图2：ST11-KL64 hv-CRKP和KL1，KL2 CR-hvKP中毒力和抗性质粒的基因组特征

综上所述，该研究发现ST11-KL64 hv-CPKP具有耐药谱广和致病性高的特点，是未来急需关注的高危克隆群。与KL1/KL2 CR-hvKP相比，ST11-KL64 hv-CRKP菌株不仅能在抗生素压力环境中存活，而且可以将毒力质粒传播至更多的CRKP菌株。ST11-KL64 hv-CRKP可对医疗卫生系统构成重大威胁，迫切需要制订相应的感染控制措施，以防止该菌株在医院环境中进一步传播。

原文链接

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36610180/

作者简介

周迎

上海市肺科医院（同济大学附属肺科医院）检验科，医学博士，研究方向：细菌耐药和传播机制研究。主持国家自然科学基金青年基金和上海市启明星计划扬帆专项各一项，以第一作者/共同第一作者在Drug Resistance Updates, Emerging Infectious Disease, eBioMedicine Emerging Microbes & Infections, Journal of Antimicrobial Chemotherapy等权威期刊发表SCI论文12篇。

余方友

上海市肺科医院(同济大学附属肺科医院)检验科主任、医学博士、教授/主任技师、博士研究生导师。先后主持课题19项，其中国家自然科学基金面上项目7项。以通讯作者或第一作者发表论文180余篇，其中SCI收录论文100余篇。获中华医学科技奖一等奖和浙江省科学技术奖一等奖各1次；为浙江省新世纪151人才工程第一层次人才、浙江省卫生高层次创新人才等。中国防痨协会结核病基础分会副主任委员、中国防痨协会人兽共患结核病分会副主任委员、中国医促会临床微生物学与感染分会常委等。

作者：周迎 （上海市肺科医院）；审校：余方友 （上海市肺科医院）

本文转载自订阅号「京港感染论坛」（ID：PIDMIC）

原链接戳：【前沿速递】KL1、KL2和ST11-KL64型碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的特征差异

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

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