前言

目的：探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的分子流行病学特征、耐药机制和感染临床危险因素，研究其耐药性与毒力之间的交互关系。

方法：收集2016年11月至2023年10月于青岛市市立医院住院患者中分离的肺炎克雷伯菌（KP）菌株共528株及其对应的临床资料。根据药物敏感性试验结果确定80例CRKP感染患者作为CRKP组。以“分离日期前后7天内分离出 CSKP 菌株”为条件，为每例CRKP患者匹配分离出碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）菌株的患者；匹配不足时将分离日期扩大至前后30天，最终共匹配出160例患者构成CSKP组。对所有入组菌株进行全基因组测序，系统研究其分子流行病学特征和耐药、毒力基因谱；采用多因素logistic回归模型筛选出CRKP感染的独立危险因素；通过Spearman相关系数分析，探索耐药性与毒力间的关系。

结果：多因素logistic回归分析结果显示，感染前30天内抗菌药物使用史（OR=4.411，95%CI：1.749~11.128，Wald χ²值：9.882，P<0.01）和感染前30天内进行腹部侵入性操作（OR=6.846，95%CI：3.141~14.922，Wald χ²值：23.411，P<0.01）是CRKP感染的独立危险因素。分子流行病学分析结果显示，CRKP感染以ST11型（80.0%）为主；blaKPC-2基因（88.8%）为主要耐药机制。CRKP 优势克隆 ST11经历了从 ST11-K25/O5向 ST11-K64/O2a 的血清型演变。整体层面耐药基因得分与毒力基因得分呈负相关（ρ=-0.321，P<0.001），但亚组分析结果显示同一ST11克隆内部两者无相关性（ρ=0.020，P=0.872），这提示整体负相关是不同克隆群固有表型差异导致的群体假象，而非同一克隆获得耐药后毒力下降的进化权衡。重症监护病房（ICU）是 CRKP 院内克隆传播的核心节点，优势克隆可通过转科患者、医护人员或医疗器械向普通病房扩散，形成跨科室传播链。

结论：CRKP感染前30天内抗菌药物使用史和感染前30天内进行腹部侵入性操作是其独立危险因素。CRKP常携“捆绑式”耐药质粒，呈广泛耐药。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是临床常见的革兰阴性条件致病菌之一，常引发肺炎、脓毒症等多种院内感染^［1］。抗生素耐药（antimicrobial Resistance，AMR）已成为21世纪主要的公共卫生威胁之一^［2］。其中，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的检出率不断上升，已经成为一种全球性威胁^［3］。根据中国抗菌药物监测网（Chinese antimicrobial surveillance network，CHINET，www.chinets.com）和全国细菌耐药监测网（China antimicrobial resistance surveillance system，CARSS，https：//carss.cn/）的数据，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率呈快速增长态势^［4］。而碳青霉烯类药物通常被认为是治疗产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBL）肠杆菌目细菌所致重症感染的最后防线。CRKP的流行严重地限制了临床治疗的选择，并且与感染患者病死率增高、延长住院时间，增加医疗费用密切相关^{［5, 6, 7］}。

肺炎克雷伯菌可分为以院内机会性感染为主、毒力较低、易多重耐药的经典型肺炎克雷伯菌（classical Klebsiella pneumoniae，cKP）和侵袭性强、可致健康人群严重感染的高毒力型肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）^{［8, 9］}。传统观点认为耐药性与高毒力表型在肺炎克雷伯菌中是相互排斥的两种特征，其核心依据是“进化权衡”理论^{［10, 11］}。但近年来高毒力碳青霉烯耐药菌株报道逐渐增多，二者的交互关系及本地流行特征仍不明确。

本研究通过对青岛市市立医院CRKP和碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-susceptible klebsiella pneumoniae，CSKP）的临床队列进行系统性分析，旨在明确CRKP感染的独立临床危险因素，解析本地流行菌株的分子流行病学特征及耐药、毒力基因谱差异，探讨耐药性与毒力之间的潜在关系。

对象与方法

一、研究设计与患者入组

1. 菌株来源：本研究为回顾性病例-对照研究。收集青岛市市立医院2016年11月至2023年10月期间住院患者临床标本中分离的KP菌株共528例。采用VITEK 2系统（美国bioMérieux公司）测定耐药表型，并以肉汤微量稀释法与纸片扩散法复核，结果按（clinical and laboratory standards institute，CLSI）指南判读。本研究方案获得青岛市立医院伦理委员会的批准（XM：2023-030）。

2. 临床感染确诊判别标准：无菌部位标本病原体检测阳性（微生物学证据）。且具备以下明确临床感染证据之一：（1）感染相关症状与体征：存在全身性感染表现和（或）局部感染特异性症状、体征^［12］；（2）炎症反应指标异常：炎症标志物水平升高（参考判定标准：降钙素原≥0.5 μg/L^［13］或C反应蛋白>50 mg/L^{［14, 15］}）；（3）影像学诊断依据：感染对应部位影像学检查可见与临床症状体征相符合的感染病灶。

3. 分组：根据药敏学结果，将患者分为CRKP组和CSKP组。CRKP与CSKP定义参照《中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识（2021）》^［16］。剔除同一患者相同部位的重复分离株。通过筛选，共从临床标本中获得80株CRKP菌株，对应患者纳入CRKP组；以“分离日期前后7天（±7 d）内分离出CSKP菌株”为匹配条件，对CRKP组患者进行匹配，对应患者纳入CSKP组，若无足够CSKP病例，则匹配范围扩大至前后1个月（±30 d），共获得160 株CSKP菌株（图1）。此匹配策略旨在控制科室特异性诊疗实践及院内感染暴露风险等混杂因素。

注：CRKP：耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；CSKP：碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌；KP：肺炎克雷伯菌

图1  2016年11月至2023年10月青岛市市立医院CRKP与CSKP感染患者入组流程图

4. 高毒力菌株判定标准：依据《高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染诊治与防控专家共识》，hvKP诊断金标准为表型验证（拉丝试验阳性或小鼠 LD₅₀≤10⁶ CFU）^{［8, 9］}。无表型验证时，同时携带≥4个核心毒力基因（iucA/iutA、iroB、rmpA/rmpA2、ybt、clb 等）可提示潜在高毒力特征。

5. 标本来源：根据患者所在科室，将临床科室归纳为重症监护病房（intensive care unit，ICU）、普通病房和急诊病房。将标本类型归纳为呼吸道标本（痰液、肺泡灌洗液、咽拭子）、血流/导管相关（血液、外周导管）、无菌体液（胆汁、腹水、胸腔积液）、脓液/伤口相关感染标本（脓肿穿刺液、引流液、分泌物、脓液、伤口分泌物、渗出液）、尿液五类。

二、临床资料收集

本研究收集所有入组患者的临床信息，包括人口统计学特征（性别、年龄）、基础疾病谱（如高血压、冠心病等）、医疗暴露史（包括感染前30天内是否入住ICU、感染前30天内抗菌药物使用情况、感染前30天内是否进行有创机械通气等）。

三、菌株分离鉴定与全基因组测序

从患者临床样本中分离出肺炎克雷伯菌菌株，分离纯化后保藏。使用MGISEQ-T7或者MGISEQ-T20进行全基因组测序（PE150模式）。得到序列后，使用GTDB-tk v2.3.2鉴定细菌物种，Spades v3.13.1实现基因组拼接，GeneMark S-2v 1.14_1.25_lic进行基因预测，经QUAST v5.2.0、BUSCO v5.2.2和CheckM v1.1.2进行质控。

四、基因组分析流程

在美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）数据库下载七个管家基因（gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB）的基因序列，构建多位点序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）数据库。比较不同菌株的ST分型，确定它们之间的遗传关系，进而了解我院KP的流行病学和种群结构。

五、耐药与毒力基因分析

使用CARD、NCBI、ResFinder数据库中所记录的抗菌药物耐药基因和突变信息，对bla_KPC-2、bla_NDM、bla_DHA-1等获得性耐药基因进行序列比对与筛查^［17］。通过毒力因子数据库（VFDB）鉴定iucA、iroB、rmpA等关键毒力基因^［18］。

六、基因评分体系

为了定量评估耐药性与毒力之间的关系，为每一株分离菌株构建了基因评分体系，参考了基于全基因组数据标准化分析工具Kleborate所建立的量化模型，将复杂的基因谱转化为可重复比较的数值^［19］。

“耐药基因得分”耐药评分计算如下：0=无ESBL酶或碳青霉烯酶；1=产ESBL酶，无碳青霉烯酶（不考虑多黏菌素耐药性）；2=碳青霉烯酶，无多黏菌素抗性（不考虑ESBL）；3=产碳青霉烯酶，多黏菌素抗性（不考虑ESBL）。同理，“毒力基因得分”根据耶尔森菌素（ybt）、大肠菌素（clb）和气杆菌素（iuc）的存在与否进行毒力评分：0=都不存在，1=仅存在ybt，2=存在clb而不存在iuc，3=仅存在iuc，4=存在iuc和ybt而不存在clb，5=三种均存在^［19］。此方法将复杂的基因谱转化为可量化的数值。

为进一步完善毒力量化评价体系、提升结论稳健性，本研究同步建立扩展版毒力评分体系，在原有ybt、clb、iuc核心毒力基因基础上，额外纳入 rmpA/rmpA2、iroB毒力基因共同赋分：iuc、clb各计2分，ybt、rmpA/rmpA2、iroB各计1分，各项得分累加为扩展版毒力总分，总分范围 0~7分。该评分模式全面覆盖本研究检测的五类关键毒力相关基因，实现菌株毒力特征的精细化量化评估。

七、统计学分析

采用SPSS 25.0软件，符合正态分布的计量资料以x¯±s表示，采用t检验；非正态分布以M（Q₁，Q₃）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以n（%）表示，采用χ²检验或Fisher精确检验。多重比较采用Bonferroni 法校正检验水准。在本研究中，连续变量年龄被转换为二分类变量用于单因素分析。基于常见的临床年龄分层及研究需求，本研究以65岁为界，将患者分为“≥65岁组”与“<65岁组”。将单因素分析中P<0.05的变量纳入多因素logistic回归模型分析CRKP感染的独立危险因素。采用Spearman相关系数分析评估耐药得分与毒力得分的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CRKP感染的临床危险因素分析

CRKP感染单因素分析结果表明，与CSKP组相比，CRKP组患者在年龄、多项基础疾病以及30 d内医疗暴露史等方面差异均有统计学意义（均P<0.05）（表1）。对有统计学意义的单因素进行多因素二元回归分析，在校正混杂因素后，多因素二元回归分析提示感染前30天内抗菌药物使用史（OR=4.411，95%CI：1.749~11.128，Wald χ²值：9.882，P<0.01）和感染前30天内进行腹部侵入性操作（OR=6.846，95%CI：3.141~14.922，Wald χ²值：23.411，P<0.01）是CRKP感染的独立危险因素（表1）。

二、CRKP菌株的耐药表型特征

药敏结果（图2）显示，CRKP菌株呈现出广泛的耐药谱系，其对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达96.3%（77/80）和100%（80/80）。此外，该组菌株对头孢类、喹诺酮类及氨曲南的耐药率均超过90%，对替加环素（耐药率3.8%）和多黏菌素（耐药率11.3%）仍有较高的敏感性。

图2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）与碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）对常用抗菌药物的耐药率比较

三、CRKP菌株的分子流行病学特征

1. 耐药基因谱特征：如图3所示，CRKP菌株的耐药基因谱表现中最核心的特征是碳青霉烯酶基因bla_KPC-2（88.75%）和超广谱β-内酰胺酶基因bla_CTX-M-65（66.25%）的高携带率。CRKP菌株中针对其他主要抗菌药物的耐药基因也具有较高携带率：介导氨基糖苷类耐药的基因rmtB（72.50%），以及质粒介导的喹诺酮耐药的基因QnrS1（61.25%）。同时，CRKP菌株中磺胺类耐药基因sul2、甲氧苄啶耐药基因dfrA1、消毒剂抗性相关基因qacEdelta1等在CRKP中的检出率亦明显高于CSKP。

图3 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）与碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）耐药基因携带率（%）检测结果

CSKP菌株的耐药基因谱呈现ArnT（100%）、oqxA（99.37%）和eptB（98.75%）的高携带率。此外，磷霉素耐药基因FosA6携带率高达86.87%。其他多种外排泵基因（如acrD，mdtC/B）及针对四环素、磺胺类等传统抗生素的耐药基因（tet（A），sul1）也有一定表达（15%~45%）。

2. MLST分型特征分析：多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）结果显示，CRKP与CSKP菌株的群体结构差异有统计学意义（Pearson χ²=167.050，df=2，P<0.001）。进一步对各ST分型检出率进行独立四格表检验，通过Bonferroni多重比较校正后α′=0.006 25，P<0.01，具有统计学意义。CRKP组ST11克隆检出率（80.0%）显著高于CSKP组（1.3%，P<0.001）；CSKP 组ST23克隆（25.6%）、其他STs检出率显著高于CRKP组（P<0.001）；而 ST1586、ST15、ST65、ST412、ST29在两组间检出率差异无统计学意义。CRKP 呈现高度克隆聚集，以ST11为主；CSKP遗传多样性更高，优势克隆为ST23（表2）。

3. CRKP 优势克隆的血清型演变、融合进化及院内传播特征：对CRKP菌株的耐药基因（bla_KPC-2、bla_CTX-M-65等）、毒力基因（iucA、ybtP等）、临床信息及分型进行热力图制作，如图4所示。

图4  2017—2023年青岛市市立医院80株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分子流行病学特征及临床信息热力图（菌株按分离时间先后排序）

时间动态变化趋势：早期（2017—2021年）ST11-K25/O5为优势流行菌株，后期（2021—2023年）优势流行菌株转变为ST11-K64/O2，2019年1月之后，开始出现同时携带iucA/iucB/iucC 和 ybtP/ybtQ 的ST11菌株。

科室传播特征：ICU 是 CRKP 检出率最高的科室，也是院内克隆传播的核心节点，分离菌株以 ST11 及其变异体为主，基因谱同源性高，标本多来源于血流、导管及呼吸道。普通病房与急诊的 CRKP 菌株 ST 型多样，耐药与毒力基因谱零散，以散发为主。

四、耐药性与毒力的拮抗关系分析

对 240 株肺炎克雷伯菌的毒力与耐药评分行Mann-Whitney U检验，结果显示两组评分呈反向分布特征：CSKP菌株毒力评分整体高于CRKP菌株（Z=-2.378，P=0.017），其中3~4分高毒力株占比46.9%，高于 CRKP 组的 23.8%；CRKP菌株耐药评分整体显著高于CSKP菌株（Z=-12.429，P<0.001），3~4分高耐药株占比达96.3%，远高于CSKP组的 5.6%。

对全部菌株的毒力与耐药得分进行相关性分析（图5）表明，耐药基因得分与毒力基因得分之间呈负相关（Spearman相关系数ρ=-0.321，P<0.01）。同时采用扩展版毒力评分体系进行相关性分析：结果显示，毒力评分与耐药评分仍呈负相关（ρ=-0.454，P<0.01）。

注：红色线连接各组中位数；箱线图显示中位数及四分位距；底部数字为各组的菌株数量

图5  肺炎克雷伯菌耐药基因得分与毒力基因得分的相关性分析

对ST11克隆的亚组进行分析，结果显示，在 66株ST11型菌株内部，Kleborate毒力评分和耐药评分之间无相关性（ρ=0.020，P=0.871）。

讨论

一、危险因素与防控启示

本研究结果显示，感染前抗菌药物使用史和腹部侵入性操作史是CRKP感染的独立危险因素，与国内外研究结论一致，ICU入住、既往抗生素使用、有创操作及合并多种基础疾病均为相关高危因素^{［20, 21］}。强调了CRKP感染主要威胁的是临床上病情危重、医疗干预密集的患者群体^［22］。究其原因，基础疾病、ICU住院史及各类侵入性操作等因素共同构成患者“病情危重且需高强度医疗干预”的临床状态，而抗菌药物的使用是驱动 CRKP 从潜在定植转化为临床感染的关键因素。

本研究采用的递进式时间匹配设计，从源头控制选择偏倚。经多因素回归分析进一步校正了基础疾病、ICU 住院史及其他侵入性操作等混杂因素后，腹部侵入性操作仍是CRKP感染的独立危险因素，与多项研究一致^{［23, 24］}，排除了选择偏倚的影响。

针对合并复杂基础病、入住ICU且接受多种操作的重症患者，强化抗菌药物管理，严格用药指征与及时降阶梯治疗是预防CRKP感染的核心举措。

二、耐药表型与治疗策略

本研究发现，CRKP对除替加环素和多黏菌素外的大多数临床常用抗菌药物均表现出较高耐药性，与CHINET监测趋势一致^［16］。随着两者临床应用的增加，其耐药性的出现和增长已有文献报道^［25］。因此，临床必须依据药敏试验个体化给药；重症感染患者，考虑采用以替加环素为基础的联合治疗方案（如联合美罗培南），延缓耐药进展、提升疗效^［26］。

三、分子流行病学特征

本地 CRKP 优势克隆为 ST11-KPC-2（80.0%），与我国及亚洲流行趋势一致^［27］。

基因谱对比显示，CRKP通过水平基因转移获得了以bla_KPC-2为核心的耐药质粒，质粒同时携带了bla_CTX-M-65、rmtB、QnrS1、qacEdelta1等多种耐药基因。这种“共携带”使得对氨基糖苷类等多种抗菌药物的耐药性也被同时传递。这既是 CRKP 呈现“泛耐药”的核心原因，也使得临床上以碳青霉烯类为基础，联合氨基糖苷类或喹诺酮类的经验性治疗面临失效的风险，是CRKP感染高死亡率的关键分子基础。

热力图分析显示：在分子分型上，流行株经历了从 ST11-K25/O5向ST11-K64/O2a的演变；这一转换，反映了CRKP为了逃逸宿主免疫压力而发生的抗原变异^［28］，进而维持了其在院内环境中的高适应度和传播优势。全球范围内O1、O2a、O3和O5血清型，在临床分离株中占比超80%^{［29, 30］}，O2a血清型在耐药菌株中比例持续上升^［31］，提示需长期动态监测优势克隆演化。

科室分布分析表明，ICU是CRKP检出率最高的科室，也是优势克隆院内传播的核心节点^［32］。ICU中频繁检出同源ST11及其变异株，且主要来源于呼吸道及血流/导管相关标本，这与危重患者集中、侵入性操作频繁以及住院时间长等高危因素密切相关^［33］。

普通病房和急诊菌株ST分型多样、多为散发，但基因型与ICU高度同源、检出时间滞后，提示优势克隆可经患者转科、医护人员、医疗器械跨病区扩散，需警惕院内感染的扩散风险。

四、耐药与毒力的进化权衡分析

对临床队列进行量化分析显示，KP耐药基因与毒力基因总分呈负相关（Kleborate评分ρ=-0.321，P<0.01；扩展版Kleborate评分ρ=-0.454，P<0.01），初步符合耐药携带增加代谢负荷、削弱毒力的“适应性成本”的理论模型^{［34, 35］}。

本研究中CRKP组与CSKP组存在显著的菌群结构差异：CRKP组以传统的低毒力ST11克隆为优势菌株，而CSKP组中高毒力克隆占比更高，这种分布差异可导致耐药与毒力评分在群体水平呈现统计学负相关。进一步开展ST11型克隆菌群亚组分析，结果显示耐药基因与毒力基因得分之间无相关性（ρ=0.020，P=0.872）。这一结果表明：本研究观察到的整体层面耐药-毒力负相关，本质上是不同克隆群间表型差异导致的假象。

进一步分析发现全部66株ST11型CRKP中有51株携带ybt基因，19株携带iuc基因，18株Kleborate评分≥4，其中5株同时携带≥4个核心毒力基因。这也解释了为何近年来CR-hvKP能够在全球快速传播：ST11等优势耐药克隆通过获得高毒力质粒，突破了传统意义上的“权衡”约束，演化为兼具高耐药与高毒力表型的“超级细菌”^［36］。近年来，CR-hvKP已在全球至少24个国家被报道，其感染严重性与治疗难度显著增加^{［36, 37, 38］}。本研究虽未开展hvKP表型验证，但检出多重毒力基因的ST11-CRKP，提示CR-hvKP克隆已出现本地流行风险，需要高度重视其防控与诊疗。

五、局限性

本研究为回顾性、单中心的设计可能引入选择偏倚；整体及非ST11菌株样本量不足，部分潜在关联无法验证，亚组分析难以进行；受限于实验条件，现阶段仅完成了毒力相关基因（iuc、ybt等）的分子生物学检测，未开展血清抗性、小鼠致死实验等表型验证实验，证据链有带完善。后续可开展多中心、大样本研究，完善体外体内功能试验。

总之，感染前30天使用抗菌药物及接受腹部侵入性操作是CRKP感染的独立危险因素。本地CRKP优势克隆为ST11-KPC-2（80.0%），blaKPC-2携带率 88.75%；菌株通过“捆绑式”耐药质粒呈现泛耐药表型，仅对替加环素、多黏菌素保有较高敏感，临床需依据药敏合理用药，防范耐药基因传播。

ST11克隆发生K25/O5向K64/O2a血清型适应性变异，部分菌株获得高毒力核心基因；ICU为菌株传播核心区域，优势克隆可跨科室扩散。

队列整体观察到的耐药、毒力负相关源于不同克隆谱系固有的遗传背景差异；ST11 可同时获取耐药、毒力基因，本研究检出携带4种及以上核心毒力基因的ST11-CRKP。不仅加深了我们对CRKP生物学行为的认知，也为未来制定更科学、更精准的临床诊疗和感染防控策略提供了重要的理论依据。

参考文献（略）

作者：张宸峥 吕森森 韩秀迪 王虹 孙怡 刘学东；第一作者单位：滨州医学院第二临床医学院；通信作者：刘学东，青岛市市立医院呼吸与危重症医学科

引用本文:张宸峥, 吕森森, 韩秀迪, 等. 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的临床危险因素与分子流行病学特征研究[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2026, 49(10): 1095-1104. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20260210-00086.

本文转载自“中华结核和呼吸杂志”

原链接：【论著】耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的临床危险因素与分子流行病学特征研究

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

责编：Jerry