摘要

感染中毒症是感染导致的全身严重炎症反应，伴危及生命的器官功能障碍，病死率高。早期明确病原体并及时针对性治疗是降低病死率的关键。微生物培养等传统病原体检测方法灵敏度低、检测周期长，不能满足感染中毒症早期病原诊断的需要。宏基因组二代测序灵敏度高，对于难以培养的病原体检测优势尤其明显，且检测时间短，为感染中毒症的病原诊断提供了新的方法。感染部位标本是病原检测的首选标本，但当感染部位标本不可及或感染灶未明确的情况下，外周血通常被用来进行病原检测。本文概述了外周血宏基因组二代测序的原理，评价其在感染中毒症病原检测中的优势和挑战，并探讨优化其诊断效用的未来方向。

关键词：感染；感染中毒症；血标本；宏基因组二代测序；病原体

感染中毒症是宿主感染后引发的严重炎症反应，伴危及生命的器官功能障碍，是临床常见的一种危重症［1］。研究报道，2017年全世界估计有4 890万感染中毒症病例，其中有1 100万死亡病例，病死率为22.5%，占全球死亡人数的19.7%［2］。感染中毒症常见的原发感染部位包括肺部、腹部、血液、泌尿道和中枢神经系统等，确定感染部位、微生物种类和及时恰当的抗感染治疗是感染中毒症成功救治的关键［1］。精准的抗感染治疗不仅可以降低感染中毒症相关的病死率，还可以减少药物不良反应和病原体耐药情况的发生，快速准确的病原体检测对于恰当的抗感染治疗至关重要。血培养是鉴定感染中毒症病原体的金标准，但是细菌或真菌培养需要3～4 d，苛养菌培养阳性率低，病毒和非典型病原体难以培养，这导致大部分感染中毒症患者的病原学诊断不明或延迟。PCR等分子检测技术提供了更快的结果，但通常只针对预定义的病原体，检测范围狭窄。为了提高感染中毒症治疗的成功率，迫切需要更为快速和准确的方法进行病原体检测，进而指导治疗。

宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）是一种基于高通量测序的技术，能够直接从临床样本（如血液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等）中无偏倚地检测出细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体，24～48 h内即可完成，且该方法受使用抗菌药物的影响较小［3］，对感染性疾病病原体的早期检测大有帮助。《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》［4］指出，在疑似感染患者的病原学检测为阴性或无法获取合适标本时，可选取外周血mNGS作为备选检测方法。外周血mNGS在感染性疾病的诊治中已有广泛应用［5］，但是，外周血mNGS在感染中毒症病原检测中的价值仍有待评价。因此，本文对外周血mNGS在感染中毒症病原检测中价值的研究进展作一综述。

1、外周血mNGS概述

外周血mNGS是对外周血样本进行专门处理后进行核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息学分析的过程。首先利用核酸提取试剂盒对外周血样本进行核酸提取，提取的核酸经过一系列步骤进行文库构建，这些步骤包括核酸断裂、末端修复、适配体连接和PCR扩增。文库构建完成后，利用高通量测序平台进行高通量测序。对测序生成的原始数据进行严格的生物信息学处理、分析：首先与人类参考基因组进行比对，去除人类宿主序列，然后对不含人类核酸的剩余测序数据进行分类，使其与综合微生物基因组数据库（如美国国立生物技术信息中心数据库）进行比对，以识别细菌、病毒、真菌或寄生虫等。由于外周血中人源DNA的比例很高，因此对于mNGS来说这是一个具有挑战性的临床样本。研究显示，以全血为mNGS检测样本时，宿主DNA比例约占99.9%，以血浆为mNGS检测样本时，宿主DNA比例约占97%［6］。血浆中微生物游离DNA仅占总游离DNA的很小一部分，主要来自于微生物菌体和核酸片段入血。去除人源性核酸的技术包括化学试剂差异裂解［7］、利用CRISPR-Cas9系统选择性杂交［8］、差速离心［9］和过滤［10］等。但是这些方法也引发了新的问题，例如部分病原体核酸在此过程中丢失［11］，并且增加了污染风险，未来新型过滤膜的研发可能克服这些问题［12］。此外，研发去除人源性核酸的新技术将大幅提高mNGS检测的灵敏度，标准化操作方案和质量控制措施对于减少假阴性结果、确保更加可靠地检测低丰度病原体至关重要。

有学者对如何进一步提高外周血mNGS检测感染中毒症病原体的灵敏度进行探究。研究显示，血浆mNGS检测细菌和真菌的灵敏度为100%，检测病毒的灵敏度为97%，均高于血细胞mNGS（细菌和真菌的灵敏度为88%，病毒的灵敏度为71%），血浆和血细胞同时进行mNGS可提高感染中毒症病原体检测的灵敏度［13］；同时进行血浆和支气管肺泡灌洗液mNGS具有明确更多致病性病原体的优势，可改善肺炎所致感染中毒症的预后［14］。这些研究提示多部位样本mNGS检测是未来发展的方向之一。另外，新兴技术如数字PCR和靶向测序面板，通过提供已鉴定微生物的定量验证对mNGS进行补充，有望提高mNGS检测的准确性。

2、外周血mNGS在感染中毒症病原检测中的价值

2.1 外周血mNGS能够更早更准确地检出病原体

外周血mNGS直接从血标本中提取核酸片段，与已知病原体基因库比对，鉴定病原体，具有检测阳性率高、灵敏度高、检测速率快和受抗菌药物影响小的特点，有助于早期检出病原体。与血培养相比，外周血mNGS表现出更短的检测周期（27.0 h比96.0 h）［15］。多项研究显示，在感染中毒症患者中，外周血mNGS的病原体检测阳性率显著高于血培养［16-20］，并且对真菌检出具有明显优势［16］。但是在原发感染部位不同的感染中毒症患者中，外周血mNGS的病原体检测阳性率存在差异，例如在腹腔感染所致感染中毒症患者中，血浆mNGS的病原体检测阳性率为55.9%［21］；在肺炎源性感染中毒症患者中，血浆mNGS的病原体检测阳性率为61.7%［14］；在血流感染合并感染中毒症患者中，血mNGS的病原体检测阳性率为77.7%［22］。不同的采血时间也会影响外周血mNGS的病原体检测阳性率。Grumaz等［19］在不同时间点采集血样进行血培养和血mNGS检测，结果显示，感染中毒症发作时采集血样，血培养的阳性率为33%，mNGS的病原体检测阳性率为72%；在整个研究期间，血培养的阳性率为11%，mNGS的阳性率为71%。虽然外周血mNGS的阳性率也会受使用抗菌药物的影响，但与血培养相比，外周血mNGS受抗菌药物的影响较小，其病原体检出中位持续时间更长［23］。此外，影响外周血mNGS阳性率的因素还包括急性生理和慢性健康状况Ⅱ评分、血液系统疾病、风湿免疫系统疾病、恶性肿瘤和高血压等［16］。在不同的研究中，外周血mNGS检测感染中毒症患者病原体的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值存在差异（表1），一项meta分析结果显示，外周血mNGS在感染中毒症病因诊断中的灵敏度、特异度和受试者操作特征曲线曲线下面积分别为81%、50%和0.81［29］。这些研究数据表明外周血mNGS虽然具有较高的灵敏度，但特异度较低，因此在结果解读时需要结合临床数据进行综合判定。对于核酸提取时难以裂解的微生物，如诺卡菌、分枝杆菌、毛霉、曲霉、隐球菌等，即便其在测序报告中的读数低，仍需考虑其致病性，这在识别感染中毒症致病病原体时非常重要。

2.2 外周血mNGS对非典型病原体感染、罕见感染和复杂感染的识别性好

血培养等传统检测手段对非典型病原体感染、罕见感染和复杂感染的病原诊断价值有限，而mNGS在其临床诊断和治疗中展现出独特优势。Chen等［30］报道了1例基础疾病为抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎的感染中毒症患者，外周血mNGS检出人型支原体，给予相应治疗后，患者病情逐渐得到控制，未进一步出现并发症，好转出院，并且在3个月的门诊随访期间，没有报告症状或临床体征复发。Bu等［31］报道了1例慢性粒细胞白血病患者在化疗和免疫治疗后出现发热和肺炎，该患者的血培养结果鉴定出多种“病原体”，并给予各种“敏感药物”治疗，然而真正的病原体被忽视，直到通过外周血mNGS检出高序列的军团菌。鹦鹉热衣原体感染的主要表现是肺炎，严重感染者容易引起感染中毒症和多器官功能衰竭，研究显示外周血mNGS检测有利于鹦鹉热衣原体的早期检出［32］。Tang等［33］报道了1例60岁女性多发性肌间脓肿患者，尽管接受了抗感染治疗，但仍迅速进展为感染中毒症，其外周血mNGS检测到结核分枝杆菌复合群，同时对其右上肢脓肿穿刺液进行mNGS检测也检出结核分枝杆菌复合群，该患者在接受抗结核治疗后逐渐康复。上述研究表明，外周血mNGS可以协助诊断人型支原体、军团菌、鹦鹉热衣原体、结核分枝杆菌等非典型病原体所致的感染中毒症。

在复杂感染和罕见感染诊断中，外周血mNGS亦具有明显优势。Fan等［34］介绍了1例免疫功能正常的64岁女性肝脓肿、感染中毒症患者，其发病原因为消化道来源的多种厌氧菌，mNGS在其外周血和肝脓肿穿刺液中检测到4种类型厌氧菌，该患者经美罗培南和甲硝唑联合治疗后逐渐好转。Pan等［35］报道了1例由嗜肺军团菌和坏死梭杆菌联合感染引起的罕见感染中毒症病例，该患者的支气管肺泡灌洗液和外周血mNGS均检出嗜肺军团菌和坏死梭杆菌。Zhou等［36］的研究显示，122例感染中毒症患者经外周血mNGS检测到的病原菌中，44.3%为革兰阴性细菌，12.3%为革兰阳性细菌，7.4%为真菌，混合感染（至少2种病原菌）占31.1%。此外，外周血mNGS还可以识别病毒感染，一项纳入74例ICU感染中毒症患者的研究发现，约29.7%的感染中毒症患者外周血mNGS检出了巨细胞病毒，是该研究队列中最常见的病毒性致病微生物［18］。上述研究表明，外周血mNGS能协助早期鉴别疑难感染中毒症患者的病原体。

2.3 外周血mNGS在特定感染中毒症群体中的应用

在新生儿、儿童、免疫低下人群等特殊群体中，外周血mNGS的应用改善了感染中毒症的病原学检测现状。一项主要纳入外周血样本的系统综述显示，外周血mNGS病原体检测提高了新生儿和儿童感染中毒症的病原学鉴定水平，并且在难以培养的细菌、病毒、真菌和寄生虫检测中，mNGS的病原诊断优势更加明显［37］。在免疫功能低下的感染中毒症患者中，外周血mNGS的灵敏度显著高于血培养［38］。在传统病原学检测方法结果为阴性的感染中毒症患者中，免疫功能低下患者的mNGS阳性率高于免疫功能正常患者［39］。这些证据表明，外周血mNGS对免疫功能低下的感染中毒症患者的病原体检测价值更大。

2.4 外周血mNGS在检测感染中毒症病原体耐药性中的应用

病原体耐药性已成为一个严重的全球性威胁问题。广谱抗菌药物的使用比例一直居高不下［40］，这将加剧病原微生物的耐药性。为了缓解这种危机并减缓耐药性的出现，降低抗菌药物治疗失败的风险，必须采取有针对性的治疗方法。确定致病病原体的耐药性后开始抗菌药物治疗，这种策略既能确保治疗有效，又能最大限度地减少耐药性进一步发生，因此亟需快速鉴定病原体及其耐药性的检测技术。mNGS除了可以快速检测病原体外，还可以检测病原体的耐药性。Lu等［41］研究发现mNGS检测到的耐药基因与鲍曼不动杆菌的耐药表型高度一致，这表明mNGS检出的耐药基因能够预测耐药性。但需要注意的是，mNGS对耐药菌基因组覆盖率低会导致假阴性结果，影响其对病原体耐药性的预测。目前，外周血mNGS在耐药性检测方面的作用仍有限，Langelier等［42］开发了CZ ID耐药模块，这种方法整合了病原体和耐药基因检测的mNGS和全基因组测序数据，以同时检测病原体和耐药基因。相信随着技术的进步，感染中毒症患者病原体耐药性检测也可以做到快速、准确，为患者精准治疗提供可靠依据。

3、总结与展望

外周血mNGS虽然具有快速、高效的优点，但也存在一些局限性。首先，mNGS的检测成本高于传统的病原体检测技术［43］，这限制了其广泛应用，开发针对感染中毒症的靶向mNGS检测能显著降低检测成本。其次，虽然mNGS理论上可以检测所有病原体的核酸序列，但是目前的技术还不能完全取代传统病原体检测技术。例如，在外周血样本收集、储存和运输过程中，如果处理不当，很容易导致污染和核酸降解，出现假阳性或假阴性结果。有效的采血部位和周围皮肤消毒、尽量在抗菌药物应用前采样、采样后按照标准对样本进行储存和运输、及时送检等，有助于减少检测误差。对于外周血本身低病原体负荷、采样前应用抗菌药物导致外周血病原体减少、因核酸量少导致文库构建失败等情况，mNGS联合多重PCR或探针捕获等技术对核酸进行富集，可以减少假阴性结果。另外，从样本中提取核酸序列时，有必要区分污染微生物、定植微生物和宿主的核酸序列，而感染中毒症患者使用外周血进行mNGS检测时，很难区分不同解剖部位的典型病原体和共生微生物。临床医生应该根据每位患者的免疫状态、合并症、临床表现和对治疗的反应，正确解读外周血mNGS检测的结果。若外周血mNGS结果与患者的临床表现和其他实验室检查相符，推荐根据结果指导临床决策；若外周血mNGS结果为阳性且与患者的临床表现相符，但缺乏除外周血mNGS结果外的其他实验室检查证据支持，应进行PCR验证（在具有合适引物的条件下），并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证；若外周血mNGS结果为阳性，但临床表现或其他实验室检查结果不支持，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据；若外周血mNGS结果为阴性，但根据其他实验室检查结果（如培养）高度提示感染可能，因而不能完全排除感染的患者，建议必要时再次取样重复检测［4］。

mNGS技术与其他技术结合也展现出巨大的发展潜力。将mNGS检测和人工智能结合能够更准确地预测病原体的药物敏感性［44］。mNGS检测与转录组学或蛋白质组学相结合，能够更深入地了解宿主-病原体相互作用和疾病的发病机制［45］。未来需要更多的研究将外周血mNGS检测结果与临床表现、传统病原体检测结果、影像组学等联系起来，开发协助临床医生正确解读外周血mNGS结果的诊断模型，提高临床诊断的准确率，为患者提供精准治疗。

总之，外周血mNGS可作为感染中毒症的辅助诊断工具，与传统病原体检测方法联合使用可显著提高病原诊断的准确率。在免疫抑制、合并基础疾病、重症和疑难复杂的感染中毒症患者中，早期使用外周血mNGS检测可快速获得病原学证据，从而指导治疗。在肺部感染相关感染中毒症患者中，呼吸道标本mNGS可以快速提供病原学诊断依据，而外周血mNGS可以作为一种有效的补充诊断措施。另外，mNGS技术与其他技术的结合将推进该技术在感染中毒症等感染性疾病中的应用，优化治疗，改善患者预后。

（参考文献略）

李丹¹ 李媛媛² 张琦³ 苏欣¹

1. 南京医科大学临床医学院南京鼓楼医院呼吸与危重症医学科，南京 210008；

2. 南京大学医学院附属鼓楼医院呼吸与危重症医学科，南京 210008；

3. 徐州市中心医院呼吸与危重症医学科，徐州 221000

本文转载自订阅号“国际呼吸杂志”

原链接戳：【综述】外周血宏基因组二代测序在感染中毒症病原检测中的价值研究进展

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