前言

近年来，随着激素及免疫抑制剂的广泛应用，免疫功能低下宿主（Immunocompromised Host，ICH）的感染发生率呈现增长趋势，肺部是最常见感染部位，病原体涵盖细菌，真菌、病毒、寄生虫及其他新兴病原体等，如未得到及时准确地诊治，致死率极高[1, 2]。本文分享一例ICH的肺部感染，且看实验室如何运用各种检测手段，拨开层层云雾，揭开谜底。

病原学诊断部分

某日，呼吸科送来一份肺泡灌洗液（BALF）标本和纤支镜刷片，BALF外观清亮，仅见少量絮状物（见图一）。若是细菌感染导致的急性炎症，主要以中性粒细胞渗出为主，样本往往为脓性或浑浊，这样的样本，会是感染吗？

图一

BALF标本接种后离心制片，纤支镜刷片进行抗酸染色，主管医生告知：该患者长期使用激素（图二、图三）。思考：免疫功能低下人群，罹患感染性疾病的几率较高，且需关注少见病原体。

图四：弹力纤维（纤支镜刷片抗酸染色）

纤支镜刷片抗酸染色镜检：可见弹力纤维（见图四），提示组织破坏严重。在肺部，肺癌、肺结核、肺部真菌感染、肺脓肿、金葡菌肺炎等疾病中常见。临床诊断：社区获得性肺炎(CAP)，非重症。38岁年轻女性，免疫功能低下，需排除肺结核，但镜检显示抗酸阴性。经仔细寻找，可见双凹圆盘状物，形似红细胞（见图五,六），但红细胞抗酸染色时很难保留原始状态，易破坏（见图七,八）。那这会是什么呢？

抗酸染色对于抗酸杆菌的识别特异性高，但对其他病原分辨率低，于是，将刷片脱色后革兰染色镜检：可见卵圆形酵母菌样真菌孢子，不易着色或着色斑驳不均，单极出芽，体积相差较大，可见巨大的酵母细胞，似泰坦细胞，菌体外隐约可见荚膜。

图九：纤支镜刷片：革兰染色（油镜）

注：泰坦细胞（Titan Cell）：隐球菌在感染过程中可形成异常增大的细胞，胞体直径大于15 µm或总尺寸（包括荚膜）超过 30 µm，被称为泰坦细胞。因体积巨大，很难被吞噬，可在机体内长期存活，泰坦细胞是其适应宿主，逃避人体免疫反应的机制之一[3]。

BALF革兰染色涂片镜检：合格标本，以巨噬细胞为主，中性粒细胞少见，未见细菌及真菌菌丝，但可见少量卵圆形酵母样真菌孢子，有颗粒感，菌体外一圈淡粉色粘液层，细胞壁塌陷，似方向盘 ©（见图十、图十一）。

BALF涂片：革兰染色(油镜)

根据以上形态学特征，初步考虑隐球菌感染可能性大，但完整的病原学诊断还需结合临床。

病情介绍

现病史：患者女，38岁，因「咳嗽1月，头痛半月，发热1天」门诊以肺部感染收治入院。

入院前两月，患者无明显诱因反复出现上呼吸道症状，1月前，患者反复出现咳嗽、咳痰，外院间断口服药物及输液治疗3天（具体用药不详），咳嗽症状稍缓解，入院前半月，患者出现头痛，起病初期呈全头部胀痛，后逐渐呈阵发性跳痛，院外曾行颅脑MRI，未予特殊处理。4月28日于我院门诊就诊，胸片提示右下肺感染，给予左氧氟沙星等药物口服治疗后无明显好转，后出现发热入院，最高体温37.5℃。

既往史：7月前外院明确诊断溶血性贫血，治疗后好转出院。院外长期服用「甲泼尼龙」片治疗。否认结核、糖尿病、脑血管疾病及精神疾病史。

个人史：公司职员，自述办公环境及居住环境清洁状况较好，住所周围环境较脏。否认饲养及接触宠物、禽类，鸟类者。

辅助检查：2022-05-01我院血常规:WBC:6.26×10^9/L，RBC:4.04×10^12/L，HGB:103g/L↓，N:81.6% ↑L:8.9%↓，CRP：10.780mg/L↑，PCT：0.052ng/ml↑。甲型流感病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、腺病毒IgM抗体：阳性，感染三项正常，GM试验：阴性。血培养：培养五天无细菌生长。痰涂片：WBC：少许 /LP，SCE：>10/LP，查见正常菌群细菌。痰培养：普通培养无致病细菌生长，培养无真菌生长。

05-02影像学（肺部CT）提示：右下肺片状密度增高影（右肺下叶可见条片及结节状实变影）（见图十二：肺窗），纵隔内多发淋巴结显示，部分增大（见图十三：纵隔窗）。

图十二：肺窗

图十三：纵隔窗

初步诊断

1、社区获得性肺炎，非重症；2、急性上呼吸道感染；3、血管神经头痛？4、溶血性贫血。

抗生素使用情况：入院后给予阿莫西林克拉维酸1.2g，q8h，5d，左氧氟沙星0.5g，qd，5d。治疗效果欠佳，于05-08再次行肺部增强CT，并行纤维支气管镜检查。

5-08复查肺部CT提示：右肺下叶炎症较05-02略有吸收减少但出现空洞，内壁光滑，未见明显气液平，纵隔窗无变化。（见下图十四）

气管镜提示：右肺下叶前基底段急性炎症（见下图十五）粘膜肿胀不光滑，易出血。刷检部位：右肺下叶前基底段外侧支。刷片及BALF送检脱落细胞检查：未见癌细胞。

病原学诊断思维

1、患者有咳嗽，咳痰等临床症状，支持肺部感染。

2、患者长期口服激素，免疫功能低下，具备真菌感染的易感因素。

3、影像学提示右肺下叶炎症，可见条片及结节状实变影，支持感染。

4、抗生素使用时间较长，且院外及我院两联广谱抗生素治疗效果不佳，而左氧氟沙星和阿莫西林/克拉维酸可覆盖常见社区获得性细菌感染病原体及军团菌，亦能覆盖衣原体、肺炎支原体等非典型病原体，但不能覆盖真菌，影像学提示病灶在抗生素使用后仍较前进展，存在真菌感染可能。

5、气管镜提示急性炎症，虽未能活检明确，但病灶处刷片可见酵母样真菌孢子，形态学特征疑似隐球菌，支持真菌感染。

6、BALF涂片可见酵母样真菌孢子，形态学特征疑似隐球菌。

病原学初步诊断结论

综上所述，考虑隐球菌感染可能性较大！立即联系临床（见图十六）并建议：

1、免疫功能低下患者，多项呼吸道病毒抗体阳性，存在混合感染可能，建议送检T淋巴细胞亚群检测，评估患者免疫功能。

2、隐球菌可导致慢性脑膜炎[4]，症状可不典型，IDSA隐球菌病治疗临床实践指南（2010年版）[5]、隐球菌性脑膜炎诊治专家共识2018年版等建议对于任何伴有发热、头痛以及CNS相关体征或症状的免疫功能受损患者 [6]，肺部有病灶时，应常规腰穿排除颅内感染，建议患者完善腰穿。

3、患者有发热，初次血培养阴性，或因隐球菌生长较慢，常规培养时间不足，建议再次采集血培养送检。

4、建议外送血清及BALF隐球菌荚膜抗原检测。

图十六

后续培养情况：因菌量极少，将BALF离心沉渣再次接种，48h后，离心后接种较未离心生长更多菌落（见图十七、十八），挑取该菌落涂片镜检：可见卵圆形酵母样真菌孢子，单极出芽，在母体和子细胞之间有缩窄的颈（见图十九），体外培养可见泰坦细胞（见图二十），形态学特征符合隐球菌，经鉴定为新型隐球菌。

最终诊断

新型隐球菌肺炎

T淋巴细胞亚群检测结果回报：总T淋巴细胞亚群比率CD3+：79.51%，辅助性T淋巴细胞比率CD3+CD4+：14.38%↓，抑制性T淋巴细胞比率CD3+CD8+：54.54%↓CD4/CD8：0.26%。提示患者免疫功能低下：患者有溶血性贫血，如病情允许可考虑减量或停用激素，并随访复查T淋巴细胞亚群检测。

治疗情况：确诊后，停用左氧氟沙星和阿莫西林克拉维酸，改为氟康唑0.4g，qd。

结局：5月15日好转出院，出院带药氟康唑0.4g，qd序贯治疗。

随访：6月1日复查肺部CT：右下肺病灶较5-02减少，纵隔未见肿大淋巴结影。目前仍在治疗随访中，每月复查CT。

后续治疗情况：下图为出院后复查CT与入院时对比，可见病灶明显吸收。

流行病学、致病性及临床表现

隐球菌可引起人类隐球菌病，肺部是最常见的感染部位 [7]。常因吸入空气中漂浮的隐球菌孢子而感染（见图二十三），由于孢子很小（1-2µm），吸入后可沉积在呼吸道深处，到达肺泡后，在胸膜下形成炎性肉芽肿[8, 9]，故典型的CT表现为胸膜下2cm内的结节，常沿气道分布[9]。这可能是肺隐球菌病灶多位于肺外周带，且靠近胸膜的原因。

隐球菌的影像学表现主要有：1、结节肿块型；2、实变影和磨玻璃为主；3、弥漫混合型；4、弥漫粟粒型。CT表现与患者的免疫状态相关，免疫健全患者病灶多局限，呈结节或肿块影，免疫功能低下患者影像学特征较为多变，可为结节肿块影、实变影、磨玻璃密度影单独或混合出现。而胸膜凹陷征、血管集束征、胸腔积液、淋巴结肿大、空洞等亦更多地出现在此类患者中[11, 12]。

肺隐球菌病在免疫健全及免疫低下人群中均可发病，免疫健全患者的感染多局限，可为一过性感染，而免疫功能低下患者常为进行性，少数患者可播散至全身。常见症状为咳嗽、咳痰、伴或不伴发热、头痛、胸痛、咯血、乏力、盗汗等[7, 13, 14]。据文献报道，在撒哈拉以南非洲、亚洲和南美洲等地区，新型隐球菌在HIV+ 患者中分离率较高[3]，而在我国，情况却截然不同，87.75%的肺隐球菌感染患者没有明显的免疫缺陷[15]，肺部病灶多为偶然发现。此外，长期应用糖皮质激素、器官移植、晚期恶性肿瘤、糖尿病、结节病和特发性CD4淋巴细胞减少症等为隐球菌感染的高危因素，并且在这类人群中，发生播散性感染的概率较一般人高[10]，如未得到及时有效治疗，严重者可危及生命，所以，早发现，及时干预，对症治疗尤为重要。而我们微生物人的责任就是要当好临床的眼睛，刻苦钻研，练就火眼金睛，为临床指明方向，使患者获益。

讨论部分

本文从实验室视角，逐层剖析，自形态学诊断入手，结合影像，临床，运用病原学诊断思维，优化培养流程等手段，最终分离到病原体，为临床确诊及针对性地治疗提供了依据，充分体现了形态学诊断技术在病原学诊断中的重要作用。

1、目前隐球菌病的诊断方法主要有：培养方法、分子检测、免疫学方法、组织病理学方法等，其中隐球菌荚膜抗原检测仅需采集血液标本，创伤小，对于隐球菌感染的诊断特异性敏感性高[16]，但受某些地区无收费标准、试剂成本等因素限制，未能广泛开展，如何在现有条件下利用现有检测手段，提高检出率值得我们关注和思考。

2、患者首次痰培养未能获取病原菌，或因标本采集不合格所致，由此可见，标本规范采集非常重要。

3、近年来，我室隐球菌检出率逐渐增高，这与肺泡灌洗液、纤支镜刷片等高质量标本送检率增高有关，经摸索总结出以下经验：

(1)临床与微生物需及时沟通：在该病例中，标本涂片镜检以巨噬细胞为主，中性粒细胞少，菌量少，如临床未告知患者长期使用激素，很少会考虑到感染或关注到此类病原体，容易漏检。

(2)肺组织培养为确诊肺隐球菌病的金标准，但因肺穿刺对患者有损伤，接受程度较低。而BALF、支气管毛刷等样本创伤程度小，是较好的选择。

(3)BALF受生理盐水稀释影响，往往菌量较少，离心沉渣接种或使用专用离心管富集后接种可提高检出率。

(4)我院分离的多个病例均发现纤支镜刷片中菌量较BALF中菌量大，直接刷检自病灶的支气管毛刷样本分离率或可更高。

(5)隐球菌科在科玛嘉培养基上多为淡粉色菌落，更易识别，故可同时加种，提高检出率。

4、病原微生物诊断实验室应搭建多学科，多种诊断方法，信息化诊断平台，为临床实现精准诊断提供帮助。

* 本文经鲁炳怀主任、陈杏春、徐和平教授指导审阅，在此表示感谢！

参考文献 （可上下滑动浏览）

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作者简介

向丽丽

主管检验师，重庆沙坪坝区陈家桥医院（重庆医药高等专科学校附属医院）微生物组组长，从事临床微生物检验工作11年，擅长微生物形态学检验及病原学诊断，有着丰富的微生物形态学诊断经验，对少见菌、疑难菌分离鉴定有独特心得。积累了大量临床病例及丰富的病原学诊断经验，参编临床微生物《形态学检验图谱与案例》一书，以第一作者发表SCI论文一篇，影响因子2.62。

作者：向丽丽 - 重庆沙坪坝区陈家桥医院；审校：赵鸿（北京大学第一医院）、黄金伟（丽水市人民医院）

本文转载自订阅号「京港感染论坛」（ID：PIDMIC）

原链接戳：【病例讨论】拨云见日——形态学诊断显神通